【ScienCell】人脑血管外膜成纤维细胞（HBVAF）产品使用攻略

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小白求助前辈指路

人脑血管外膜成纤维细胞培养不成功、实验做不出来怎么办？新手小白迫切求助，希望各位前辈在文章下方留言，分享自己的经验，为小白们答疑解惑！

人脑血管外膜成纤维细胞

（HBVAF）

血管外膜中的成纤维细胞构成是血管最外层的结缔组织覆盖层，通过其表型和增殖特性的变化以及分泌细胞外基质蛋白来参与血管损伤修复过程。这种变化在病理条件下对血管壁的重塑起重要作用，因此通过血管外膜成纤维细胞来调节血管张力进而针对特定部位的血管壁进行基因治疗具有的巨大潜力。

培养方式

培养瓶：PLL（多聚-L-赖氨酸）包被的培养瓶。

培养基：HBVAF用提供的FM完全培养基（包含基础培养基、2% FBS、1%FGS和1%P/S）中培养。

操作步骤：

1) 包被PLL（2 μg/cm²）培养瓶（T-75培养瓶）的准备：将10 mL无菌水加入到T-75培养瓶中，加入15 μL PLL原液，轻轻吹匀后将培养瓶放置在37°C的孵育箱中过夜（或至少1小时）。

2)无菌水清洗包被PLL的T-75 2次，加入20 mL FM完全培养基（基础培养基、FBS、FGS和P/S按比例混合配制），将解冻后的HBVAF加入至包被的T-75中，十字交叉法轻柔摇晃培养瓶使细胞分布均匀，将培养瓶放入细胞培养箱中。（注：不建议在解冻后稀释和离心细胞，因为这些操作对细胞的伤害比培养中残留的二甲基亚砜（DMSO）的影响更大。同时，将细胞放置在PLL包被的培养瓶中有助于促进细胞附着。）

换液：为了获得最佳结果，在培养开始后至少16小时内不要干扰培养。第二天更换培养基，以去除残留的二甲基亚砜和未附着的细胞，之后每隔三天更换一次培养基，直到培养达到约70%的密度，一旦培养达到约70%的密度，每隔一天更换一次培养基，直到培养达到约90%的密度。

传代：当细胞密度达到90%-95%时进行传代。

1) 将T/E、DPBS、培养基提前置于室温平衡（不建议37℃加热）。

2) 弃除旧培养基，并用DPBS清洗细胞后吸除加入5 mL DPBS和5 mL 0.05% T/E solution 轻柔晃动培养瓶后放入37℃培养箱（注：原代细胞传代时请勿使用未稀释的胰蛋白酶），一段时间后镜下观察，待细胞完全变圆、脱落，轻轻拍打底部和侧面，加入2 mL FBS（#0500）终止消化，将细胞悬液转移至15 mL离心管中，1000 rpm离心5 min，用新培养基重悬细胞沉淀后计数，根据5000 cells/cm²的密度传代至预先用PLL包被的培养瓶皿中。

生长条件：在CO₂浓度为5%，温度为37℃，相对湿度（RH）为95%的细胞培养箱中培养。

表1 HBVAF培养材料

参考文献

[1] Tsutsui M, Chen AF, O'Brien T, Crotty TB, Katusic ZS. (1998) “Adventitial expression of recombinant eNOS gene restores NO production in arteries without endothelium.” Arterioscler Thromb Vasc Biol. 18: 1231-41.

[2] Kullo IJ, Mozes G, Schwartz RS, Gloviczki P, Crotty TB, Barber DA, Katusic ZS, O'Brien T. (1997) “Adventitial gene transfer of recombinant endothelial nitric oxide synthase to rabbit carotid arteries alters vascular reactivity.” Circulation. 96: 2254-61.

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