【ATCC】人脐静脉内皮细胞（HUVEC）质粒DNA转染方法
人脐静脉内皮细胞培养不成功、实验做不出来怎么办？新手小白迫切求助，希望各位前辈在文章下方留言，分享自己的经验，为小白们答疑解惑！
人脐静脉内皮细胞
（HUVEC）
血管内皮细胞对于维持血管内环境平衡起着重要作用。血管内皮细胞产生和分泌凝血和纤溶系统的激活剂和抑制剂，释放调节细胞增殖和控制血管壁张力的分子，并介导血小板的粘附和聚集。由于易于获取和纯度高，人脐静脉内皮细胞（HUVECs）是研究内皮细胞生理学、血管生成和药物发现的最受欢迎的内皮细胞。HUVECs具有“鹅卵石”形态，细胞生长为单层紧密相对的多边形大细胞，含有原位内皮细胞特征的细胞质包涵体（Weibel-Palade小体）以及大量的平滑肌肌动蛋白，vWF/Factor VIII和CD-31特异性抗体免疫荧光染色呈阳性，并具有摄取乙酰化低密度脂蛋白的能力。培养的HUVECs也含有与组织供者血型相适应的ABH抗原，但在培养的平滑肌细胞或成纤维细胞上未检测到这些抗原。
质粒DNA转染到HUVECs的方法
注意事项：
1)所有步骤应在生物安全柜中使用正确的无菌技术进行操作。
2)细胞状态。细胞在解冻后至少传代一次，并建议使用低传代细胞。在转染前18-24小时对细胞传代，以确保细胞处于活跃分裂状态，并在转染时达到适当的细胞密度。确保细胞健康且存活率≥90%。
3)接种密度（根据表1确定）。转染当天，细胞密度应为50-80%的汇合度。注意：确定每种细胞类型的最佳细胞密度，以提高转染效率。
4)DNA纯度。使用高纯度的质粒DNA制备物，不含酚或其他污染物。最好使用无内毒素的质粒DNA制备物。
5)抗生素和其他抑制剂的添加。抗生素会抑制转染复合物的形成，因此在复合物形成步骤中应排除抗生素。如果需要，可以将转染复合物加入含有血清和低水平抗生素的完整细胞培养基中。
6)复合物形成条件。在无血清生长培养基中制备TransfeX试剂和DNA复合物。ATCC建议使用Opti-MEM I低血清培养基稀释DNA以进行复合物形成。
操作步骤：以下方案描述了如何使用TransfeX试剂将质粒DNA转染到24孔板的单个孔中的原代HUVECs中。（根据需要，反应可根据表1进行可以进行扩大。）转染效率可达70%-80%。
A. 准备转染细胞
转染前一天：
① 计数和测量细胞的密度和存活率。
②在完全生长培养基中每孔接种25,000个细胞（Vascular Cell Basal Medium 中添加血管细胞生长试剂盒-VEGF）。在37°C、5% CO2细胞培养箱中孵育过夜。细胞密度应在转染当天达到75%的汇合度。
转染当天：
①移除旧培养基。
②用新鲜的完全生长培养基（不含肝素硫酸盐）替换旧培养基，使总体积为0.5 mL/孔。
B. DNA：TransfeX转染复合物的制备
①将TransfeX、质粒DNA和Opti-MEM I低血清培养基加热至室温，并轻轻涡旋混合。
②用移液管向无菌微量离心管中加入100 µL Opti-MEM I低血清培养基。
③加入0.5 µL（1.0 µg/µL）质粒DNA。充分混合，轻轻振荡移液管。
④向稀释后的DNA混合物中加入1.0 µL TransfeX试剂。注意：不要让移液管尖端或试剂接触到塑料管的侧面。
⑤使用涡旋仪充分混合TransfeX:DNA复合物。
⑥使用小型离心机收集管底的内容物。
⑦在室温下孵育TransfeX:DNA复合物15分钟。
C. 向孔中加入DNA:TransfeX转染复合物
①将复合物滴加到孔的不同区域，每孔加入50 µL的复合物。
②轻轻摇晃培养容器，使TransfeX:DNA复合物均匀分布。
D. 转染后处理
①细胞培养箱孵育24-72小时。每24小时用新鲜的完全生长培养基替换转染培养基。
②转染后18-24小时进行转基因表达分析。
TransfeX试剂在原代HUVECs中的转染效率。细胞使用0.5 µg DNA和1.0 µL试剂（1:2比例）在Opti-MEM I低血清培养基中转染EF1α-eGFP空载体。
表 1 DNA转染至HUVECs所需材料
表 2 不同尺寸培养容器的推荐反应条件
文献应用
[1] Bartee E, McFadden G. Human Cancer Cells Have Specifically Lost the Ability to Induce the Synergistic State Caused by Tumor Necrosis Factor Plus Interferon-B. Cytokine 47(3):199-205, 2009. PubMed: 19640730.
[2] Gdula-Argasinska J, et al. Docosahexaenoic Acid Regulates Gene Expression in HUVEC Cells Treated with Polycyclic Aromatic Hydrocarbons. Toxicol Lett 236(2):75-81, 2015. PubMed: 25956473
[3] Liu H, et al. Role of SIRT3 in Angiotensin II-induced Human Umbilical Vein Endothelial Cells Dysfunction. BMC Cardiovasc Disord 15:81, 2015. PubMed: 26223796
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