【ScienCell】人肝窦内皮细胞（HHSEC）产品使用攻略

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人肝窦内皮细胞 HHSEC 人原代细胞 Human Primary cells 人肝脏细胞系统 Hepatic Cell System Hepatic Sinusoidal Endothelial Cells Sciencell Endothelial Cell Medium

小白求助前辈指路

人肝窦内皮细胞培养不成功、实验做不出来怎么办？新手小白迫切求助，希望各位前辈在文章下方留言，分享自己的经验，为小白们答疑解惑！

人肝窦内皮细胞

（HHSEC）

肝脏包含两种不同的内皮细胞类型：血管内皮细胞和血窦内皮细胞。血窦内皮细胞（SEC）是具有类树突状细胞独特表型和CD4⁺ T细胞抗原呈递细胞独特功能的微血管内皮细胞。因此，SEC代表一种新型的器官驻留的“非专业”抗原呈递细胞，参与肝脏免疫应答的局部控制和免疫耐受的诱导。肝脏微环境，包括门静脉成分和肝血窦细胞群体释放的可溶性介质，严密控制SEC的抗原呈递，以避免免疫介导的损伤。SEC表达已被充分表征的表面受体，并在形态和代谢上与大血管内皮细胞有所不同。研究表明，SEC是肝脏再生过程中对环境区域刺激快速而局部响应的动态调节者。SEC的功能障碍和结构改变对整个肝脏产生深远影响。HHSEC的可用vWF/Factor VIII/CD31(PECAM1)特异性抗体免疫荧光染色呈阳性。

培养方式

培养瓶：纤连蛋白（Bovine Plasma Fibronectin, 2 µg/cm²）包被培养瓶。

培养基：HHSEC用提供的ECM完全培养基培养（包含基础培养基、5% FBS、1% ECGS和1% P/S）。

操作步骤：

1) 包被纤连蛋白（2 µg/cm²）培养瓶的准备（建议使用T-75培养瓶）：将5 mL无菌的Dulbecco's磷酸盐缓冲盐（DPBS）与150 µL纤连蛋白原液混匀后加入到T-75培养瓶中，将培养瓶放置在37°C的孵育箱中过夜（或至少2小时）。在铺细胞前将未凝固纤连蛋白溶液吸出（可重复使用2次），加入20 mL ECM完全培养基培养（基础培养基、FBS、ECGS和P/S按比例混合配制）。

2) 将解冻后的细胞加入至T-75中，十字交叉法平晃培养瓶使细胞均匀分布，置于细胞培养箱中培养。

换液：培养开始后至少16小时内不要干扰培养。第二天更换培养基，以去除残留的二甲基亚砜和未附着的细胞，此后每三天更换一次培养基，直到培养物达到大约70%的汇聚度。一旦培养物达到70%的汇聚度，每隔一天更换一次培养基，直到培养物达到大约90%的汇聚度，及时将细胞用于实验。

传代：当细胞密度达到90%时进行传代。

1) 将T/E、包被培养皿、DPBS、培养基提前置于室温平衡（不建议37℃加热）。

2) 弃除旧培养基，并用DPBS清洗细胞后吸除加入8 mL DPBS和2 mL 0.05% T/E solution 轻柔晃动培养瓶后放入37℃培养箱（注：原代细胞传代时请勿使用未稀释的胰蛋白酶），一段时间后镜下观察，待细胞完全变圆、脱落，轻轻拍打底部和侧面，加入1 mL FBS，将细胞悬液转移至15 mL离心管中，1000 rpm离心5 min，用新培养基重悬细胞沉淀后计数，根据6000-8000 cells/cm²的密度传代至预先用Bovine Plasma Fibronectin包被的培养皿中。（注：HHSEC是非常敏感的细胞，不会在培养中多次增殖。在解冻细胞之前，实验应该进行良好的组织安排。建议使用最初培养后的最早传代HHSEC进行实验，并尽量减少细胞的扩增。如果不可避免地需要传代，务必特别小心地按照以上说明进行操作。）

生长条件：在CO₂浓度为5%，温度为37℃，相对湿度（RH）为95%的细胞培养箱中培养。

表 1 HHSEC 培养材料

参考文献

[1] Limmer A, Knolle PA. (2001) “Liver sinusoidal endothelial cells: a new type of organ-resident antigen-presenting cell.” Arch Immunol Ther Exp (Warsz) 49 Suppl 1:S7-11.

[2] Wack KE, Ross MA, Zegarra V, Sysko LR, Watkins SC, Stolz DB. (2001) “Sinusoidal ultrastructure evaluated during the revascularization of regenerating rat liver.” Hepatology 33(2):363-78.

[3] Gervaz P, Scholl B, Mainguene C, Poitry S, Gillet M, Wexner S. (2000) “Angiogenesis of liver metastases: role of sinusoidal endothelial cells.” Dis Colon Rectum 43(7):980-6.

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