【Serumwerk】近端小管细胞（The proximal tubule cells）分离
近端小管细胞分离不成功、实验做不出来怎么办？新手小白迫切求助，希望各位前辈在文章下方留言，分享自己的经验，为小白们答疑解惑！
近端小管细胞（The proximal tubule cells）分离
溶液制备
A. 灌注介质1:含0.5 mM EGTA和25 mM HEPES的无钙Hank 's平衡盐溶液
B. 灌注介质2:不含EGTA的溶液A。
C. 灌注介质3:含4mm CaCl2和0.12%胶原酶的溶液B
D. 灌注介质4:含2.5% (w/v)牛血清白蛋白(BSA)的溶液B
E. NycodenzⓇ储存:40% (w/v)存于水中
F. NycodenzⓇ稀释剂:67 mM KCl, 12.2 mM CaCl2, 100 mM HEPES-NaOH, pH 7.4
G. NycodenzⓇ(34%，w/v)溶液:将3.4体积的溶液E与0.6体积的溶液F和2体积的水混合
H. 低密度屏障溶液:将1体积溶液G与4体积溶液D混合。
试验方法
1．在37℃下实施步骤1-3并且在0-4℃下实施步骤5。保持溶液D, G和H在0-4°C。
2．用150 ml溶液A在37℃以10 ml/min的速度灌注肾脏;一旦所有的血液被冲洗干净，将流速降低到7.5 ml/min。
3．取肾后，继续灌注25 ml B溶液。
4．用C溶液在再循环系统中灌注18分钟。
5．用10ml溶液D冲洗溶液C。
6．取出胶囊并将组织分散于溶液D中。
7．将细胞悬液通过两层尼龙纱布(80目)过滤。
8．将细胞在80 g下离心3 min并在溶液D中洗涤颗粒3次。
9．将细胞重悬于4 ml溶液D中，与2 ml溶液G混合。
10．用1 ml溶液H和0.5 ml溶液D覆盖3 ml细胞悬液。
11．在2300 g下离心3分钟。
12．从下界面获取近端小管细胞。
Nycodenz® 产品信息
理化特性
●分子量：821 g/mol
●密度：2.1 g/ml
●溶于水浓度：80% (w/v)，溶于水密度：1.426 g/ml
稳定性和储存
●固体形式的Nycodenz®在室温和避光条件下可稳定保存2年。
产品特点
●非离子型，对细胞无毒，代谢惰性
●可用于细胞、亚细胞细胞器和膜、大分子和病毒的分离
●形成真正的溶剂。因此，分离后很容易从细胞中除去培养基
●能抵抗细菌降解
●溶液可以进行高压灭菌
使用方法
1. 通过离心在原位形成的(自形成渐变)。
2. 将所需浓度的溶液分层放入适当的离心管和允许的解决方案扩散。使用Nycodenz®等渗溶液梯度可以在45分钟内简单地准备好。
3. 冷冻和解冻。
4. 梯度混合器。
应用
Nycodenz®可用于核酸、蛋白质、多糖和核蛋白的分离。此外，在等渗或轻度高渗条件下，大多数类型的亚细胞器都可以在Nycodenz®的梯度上成功分离。Nycodenz®渗透压低，无毒，是分离完整活细胞的理想介质。Nycodenz®的低粘度及其非离子特性已经证明了Nycodenz®在病毒和细菌的分离和纯化方面是有用的。
可分离：
哺乳动物和非哺乳动物的细胞
亚细胞的细胞器
非哺乳动物来源的细胞器
亚细胞的膜
蛋白质和蛋白质复合物
核糖核蛋白
病毒
Nycodenz®可以通过透析、超滤或凝胶过滤从样品中去除。细胞、亚细胞细胞器和其他颗粒物质可以通过离心从Nycodenz®中分离出来，而不会有被Nycodenz®污染的风险。
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