【Serumwerk】胃壁细胞（Parietal cell）分离
胃壁细胞分离不成功、实验做不出来怎么办？新手小白迫切求助，希望各位前辈在文章下方留言，分享自己的经验，为小白们答疑解惑！
胃壁细胞（Parietal cell）分离
许多报道的密度溶液是由NycoprepⓇ1.15 (27.6% NycodenzⓇ的等渗溶液，含有3mM KCl, 0.3 mM CaNa2-EDTA, 5 mM Tris-HCl, pH 7.4， ρ = 1.15 g/ml)制备的。这不再是商业上可获得的，所以所有的溶液必须由NycodenzⓇ粉末制成。CaNa2-EDTA的存在只是为了在高压灭菌过程中期间的溶液稳定性，可以省略，缓冲液和无机盐含量可以改变，以适应操作者的要求。Berglindh制备了含有5.4 mM KCl、1.2 mM MgSO4、15 mM Tris-HEPES、pH 7.4和10 mg/ml BSA的溶液。
将100毫升ρ = 1.15 g/ml原液置于约。将50毫升水放入150毫升烧杯中，置于加热的磁搅拌器上，设置为约为100毫升。50℃并添加27.6 g少量NycodenzⓇ直至溶解。使溶液冷却至室温;加入0.5 g牛血清白蛋白，然后加入相应的溶液：5.4 ml KCl, 1.2 ml MgSO4和1.5 ml HEPES，用Tris溶液调节pH至7.4，最后用水配制至100 ml。必要时进行过滤消毒。
然后用简单的等渗稀释液(132 mM NaCl, 5.4 mM MgSO4, 0.5 mM DTT, 10 mg/ml BSA, 15 mM HEPES-Tris, pH 7.4，或128 mM NaCl, 5 mM KCl, 4 mg/ml BSA, 0.3 mM Ca/Na-EDTA, 5 mM Tris-HCl, pH 7.4) 进一步稀释ρ = 1.15 g/ml NycodenzⓇ溶液，有时使用细胞悬液培养基。
不连续梯度：1.139、1.095、1.073和1.049 g/ml 采用15毫升管中的2毫升，而1.1710、1.075、1.05和1.0375 g/ml梯度分别采用50毫升管中的10毫升、20毫升、10毫升和7毫升。在双层格式中，低密度溶液的体积通常(但并非总是)大于高密度溶液，例如在50ml的管中，8ml和5ml。
连续梯度：壁细胞通常是通过允许不连续的扩散而产生的；这通常是通过让管子直立在冰箱里过夜或通过盖管来完成；平稳地将其旋转到水平位置并在室温下放置大约。然而，在1.139,1.095,1.073和1.049 g/ml的层中，试管在6-8℃的水平位置过夜，产生连续的1.049-1.139 g/ml梯度。连续梯度也可以使用双腔梯度发生器或Gradient Master更快地产生，这两种方法都只需要使用密度最低和密度最高的溶液。
试验方法
将来自酶的细胞制成颗粒，在200 g下消化8 min并抽吸上清液。将细胞颗粒以0.1-0.15 ml / ml的浓缩细胞重悬于细胞悬浮培养基或最低密度梯度溶液中。在12-15 ml的管中，在梯度的顶部放置2 ml细胞。在50ml的管使用比例较大的体积。降低细胞浓度将使可能发生的任何细胞凝集最小化。
离心法
将四层梯度以600-1000 g离心8 min，或两层梯度以200 g离心10 min，使用缓慢加速程序，并允许转子减速没有制动。
采集在连续梯度的顶部或在不连续梯度的密度最小层以下的界面处形成的壁叶细胞。
Nycodenz® 产品信息
理化特性
●分子量：821 g/mol
●密度：2.1 g/ml
●溶于水浓度：80% (w/v)，溶于水密度：1.426 g/ml
稳定性和储存
●固体形式的Nycodenz®在室温和避光条件下可稳定保存2年。
产品特点
●非离子型，对细胞无毒，代谢惰性
●可用于细胞、亚细胞细胞器和膜、大分子和病毒的分离
●形成真正的溶剂。因此，分离后很容易从细胞中除去培养基
●能抵抗细菌降解
●溶液可以进行高压灭菌
使用方法
1. 通过离心在原位形成的(自形成渐变)。
2. 将所需浓度的溶液分层放入适当的离心管和允许的解决方案扩散。使用Nycodenz®等渗溶液梯度可以在45分钟内简单地准备好。
3. 冷冻和解冻。
4. 梯度混合器。
应用
Nycodenz®可用于核酸、蛋白质、多糖和核蛋白的分离。此外，在等渗或轻度高渗条件下，大多数类型的亚细胞器都可以在Nycodenz®的梯度上成功分离。Nycodenz®渗透压低，无毒，是分离完整活细胞的理想介质。Nycodenz®的低粘度及其非离子特性已经证明了Nycodenz®在病毒和细菌的分离和纯化方面是有用的。
可分离：
哺乳动物和非哺乳动物的细胞
亚细胞的细胞器
非哺乳动物来源的细胞器
亚细胞的膜
蛋白质和蛋白质复合物
核糖核蛋白
病毒
Nycodenz®可以通过透析、超滤或凝胶过滤从样品中去除。细胞、亚细胞细胞器和其他颗粒物质可以通过离心从Nycodenz®中分离出来，而不会有被Nycodenz®污染的风险。
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