【Serumwerk】膜运输及传导分析：胞吐作用、胞囊作用功能和质膜域靶向分析

溶液制备

A. OptiPrep™

B. 均质培养基:0.25 M蔗糖，90 mM KOAc, 2 mM Mg(OAc)₂，20 mM Hepes-KOH, pH 8.0

 试验方法

在0-4℃下执行所有操作。所有碘克沙醇浓度以% (w/v)表示。

1．将溶液B中的细胞在细胞裂解器(滚珠匀浆器)中匀浆，使用4-6代。通过相差显微镜监测均质化的效果。

2．将匀浆以800 g离心5 min，使细胞核成球。

3．将核后上清液(PNS)、OptiPrep™和溶液B按以下体积比例(3:3:0、3:2:1和3:1:2)混合，分别制备含30%、20%和10%碘克沙醇的三种悬液。

4．三层等量悬架在管中，用于垂直或近垂直转子;推荐使用11.2 ml Optiseal™管用于Beckman VTi65.1或NVT65转子。

5．以35.3万gav的速度用缓慢加速程序离心3小时。

6．允许离心机在没有刹车的情况下从2000转减速到休息或使用缓慢减速程序。

7．通过导管穿刺、半月板抽吸或向上移位收集梯度0.5 ml /次;后两种选择仅适用于Beckman Optiseal™管。

方法注释

均质化介质

均质化培养基(HM)通常必须针对组织或细胞类型进行定制，并且不知道HM的组成是否与分离相关。介绍了有机渗透平衡剂如蔗糖、甘露醇和山梨醇在亚细胞膜功能研究中的相容性;此外，这些低离子强度的HMs和梯度溶液允许直接使用馏分进行SDS-PAGE。

用无机盐(含K+或Na+离子)补充HM变得越来越常见，可以减少离子相互作用，膜之间的聚集，并对抗任何由于细胞骨架蛋白引起的匀浆粘度的提高。一些不含蔗糖的培养基完全使用氯化钠或氯化钾或两者作为主要的渗透平衡剂。HM的组成也应与任何后续分析过程兼容。二价阳离子的加入可以防止核破裂;一般稳定膜，但可能导致聚集。用Tris, Hepes, Tricine或三乙醇胺(10-20 mM浓度)缓冲溶液，如果缓冲液的类型显著影响分馏，则不太可能，尽管三乙醇胺似乎在均质化效率方面有一些优势。

Yeaman使用0.25 M蔗糖，90 mM KOAc, 2 mM Mg(OAc)₂，20 mM Hepes-KOH, pH值8.0的条件培养NRK-49F和NRK-52E大鼠肾细胞。Kolesnikova使用标准的0.25 M蔗糖，1 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl, pH 7.5梯度均质化的人肝癌(HUHT-7)和HeLa细胞，而Leblanc用1.5 mM MgCl₂取代1 mM EDTA用于小鼠胚胎成纤维细胞(3T3细胞)。可根据操作者的判断将蛋白酶抑制剂包括在溶液B中。

梯度方案

如果认为在整个梯度中保持匀浆介质中的一种或多种试剂的浓度相同是很重要的，则首先配制50%碘克沙醇的工作溶液。例如，如果匀浆缓冲液是0.25 M蔗糖、1 mM EDTA、10 mM Tris-HCl、pH 7.5，然后用1体积的0.25 M蔗糖、6 mM EDTA、60 mM Tris-HCl、pH 7.5稀释5体积的OptiPrep™。如果在步骤3中使用OptiPrep™，则所有三种悬浮液中的Tris和EDTA浓度将相同。工作溶液中渗透压平衡剂(0.25 M蔗糖)的浓度通常不改变，否则溶液会变得明显高渗。使用50%碘克沙醇工作液代替OptiPrep™的三种悬液的体积比需要改为2:3:0;分别为2:2:1和2:1:2。

梯度设置和形成

密封管需要完全填充；如有必要，可加入少量溶液B以填充管至所需水平。

用两层或三层的起始格式来调制通过自生成获得的密度剖面的能力通常是实现更线性梯度的有用手段。虽然可以认为使用单一的均匀碘克沙醇浓度形式(即没有任何界面)的重要优点之一在分层形式中失去了，但由于核后上清中的粒子在梯度中弥散而均匀地扩散，这一优点得到了改善。此外，碘克沙醇在界面上的扩散会迅速“软化”原来的密度不连续。这种情况在垂直转子中比在摆斗转子中更有效，因为大的界面表面积。尽管Yeaman等人使用垂直转子开发了这种方法，但由于任何可溶性蛋白都会沉淀到管的底部，所以接近垂直的转子可能是首选的转子。在一个垂直的转子中，蛋白质将沉淀到离转子轴最远的管壁的整个长度。随后，Andersen和Yeaman使用了近乎垂直的旋翼。

梯度分析

从一个空白梯度部分的密度可以用折射计检查。吸光度测定是一种替代方法。

Yeaman等使用的核内体标记物是syntaxin13，存在于早期和再循环的核内体中。晚期核内体、ER和溶酶体分布在较密集的部分，重叠在较轻的胞质蛋白区。另一方面，来自人类肝癌细胞的晚期核内体的密度明显低于其对应的NRK细胞。虽然这些梯度可以用于多种细胞类型，但这些梯度中膜分离模式的细节显然是依赖于细胞的。

Yeaman等比较了Sec6/8复合体在两种NRK细胞中的分布，Sec6/8复合体参与胞吐途径的功能，NRK- 49f细胞形成成纤维细胞样连接，NRK- 52e细胞形成上皮样连接。在NRK-52E细胞中，Sec6/8复合体主要与细胞质膜共分离，而在TGN/核内体或细胞质蛋白区检测到相对较少。另一方面，在NRK-49F细胞中，我们在胞质蛋白和TGN/核内体区域的两个不同组分中检测到大量的复合物。后者的模式与syntaxin13或VAMP4的模式相当不同。

Kolesnikova等人能够利用梯度监测马尔堡病毒VP40基质蛋白在感染细胞中的易位。在感染后7小时，大部分VP40与小囊泡部分相关，但随着感染的进展(长达24小时)，梯度允许通过核内体/ER区转移到质膜。

溶液梯度格式

有时PNS仅存在于最稠密的梯度层中；这是HeLa细胞的再循环和COS细胞的早期核内体分析的情况;对MDCK细胞的详细研究，包括15% (w/v)碘克沙醇层，以及对前列腺癌细胞中桩蛋白膜结合的研究，其中30% (w/v)碘克沙醇的PNS覆盖25%，20%，15%和10% (w/v)碘克沙醇；采用了近垂直转子，因此形成的梯度仍然是自产生的。

非哺乳动物细胞

利用上述方法分析了果蝇Exocyst功能，并将酵母细胞中的极化分泌囊泡输送降至TLA120.2固定角转子；将球体质体裂解物调整为40% (w/v)；将其置于35% (w/v)层下并以100,000 g离心3 h。产生这种梯度所需的低g力是使用的体积非常小的结果——0.1 ml的样本体积被1 ml 35%碘克沙醇溶液覆盖在小体积TLA120.2固定角度转子中。Chang等人和Caballero-Lima等人在研究酵母分泌囊泡时使用相同的小体积转子产生梯度。

在大多数情况下，应用于梯度或纳入梯度的分数是核后上清液(PNS)。单次离心可以在500- 1000 g的任何g力下进行5-10分钟，虽然偶尔使用后重线粒体上清液(3000 g)。有时进行更广泛的差速离心，例如MDCK细胞匀浆依次在1000 g 10分钟，5000 g 40分钟，然后100,000 g 2小时；将来自最后一次离心的颗粒施加到梯度上。更罕见的是，差速离心可能更广泛:例如，1000 g离心10分钟，5000 g离心10分钟，10,000 g离心20分钟，15,000 g离心20分钟，然后将10万g的最终颗粒重悬1小时，并纳入连续梯度中。使用PNS的优点是均质化和梯度之间的时间缩短，囊泡的损失将最小。缺点是存在所有其他大型细胞器(线粒体、溶酶体、过氧化物酶体)，这些细胞器将在梯度的密集区域带。单次5000 g离心可能是一种有用的折衷方法，它将消除大多数线粒体以及一些过氧化物酶体和溶酶体。

相关产品推荐