【Serumwerk】内质网、质膜、核内体、高尔基体、ERGIC和TGN分离——不连续梯度浮选法
内质网、质膜、核内体、高尔基体、ERGIC和TGN分离不成功、实验做不出来怎么办？新手小白迫切求助，希望各位前辈在文章下方留言，分享自己的经验，为小白们答疑解惑！
溶液制备
A. OptiPrep™
B. 均质培养基:0.25 M蔗糖，2 mM MgCl₂，1 mM EDTA, 20 mM Tricine-NaOH, pH 7.8
C. 稀释剂:0.25 M蔗糖，12 mM MgCl₂，6 mM EDTA, 120 mM Tricine-NaOH, pH 7.8
D. 50% (w/v)碘克沙醇(ρ = 1.272 g/ml)工作液：5体积溶液A +1体积溶液C
试验方法
在0-4℃下执行所有操作。
1．将细胞或组织悬浮于溶液B中并使用Dounce匀浆器匀浆。细胞可能需要通过25G或27G针重复传代，而不是(有时是另外) Dounce匀浆。
2．以800-1000 g将匀浆离心10 min。可将颗粒重悬于匀浆介质中;重复离心，必要时将两种上清液合并。
3．将上清液以16,000 g离心30分钟。
4．将颗粒重悬于1.5 ml(总体积)溶液B中，与等体积溶液D混合。
5．将5%、10%、15%和20% (w/v)碘克沙醇溶液各10 ml，混合溶液B和D的适当体积。
6．在摆动转子的13ml管中，通过使用注射器和金属套管的分层技术，从四种梯度溶液和样品各2.5 ml中形成一个不连续的梯度，用于摆动桶转子的13 ml管。如有必要，用5%碘克沙醇将导管充盈至正确位置。
7．以88,000 g离心18 h。
8．如果在梯度内的材料是可见的一系列明确定义的带收集他们使用注射器和金属套管。否则，可以通过导管穿刺、半月板抽吸或向上移位的方式，以0.5 ~ 1.0 ml的剂量卸载梯度。
方法注释
1． 根据操作者的决定，蛋白酶抑制剂可包括在任何或所有介质中。用于制备密度溶液的溶液可含有替代缓冲液，如Tris, Hepes或三乙醇胺。
2．这种稀释剂，用于制备50%碘克沙醇工作液(溶液D)，确保EDTA和缓冲液的浓度在整个梯度过程中保持恒定，这将或多或少地是等渗的。
3．可采用其他较大或较小管容量的摇斗转子；按比例放大或缩小所有卷。
4．均质化方案需要根据细胞或组织类型进行调整。目前尚不清楚不同的均质化介质或方案将对分离产生什么影响。
5．以描述的方式清洗颗粒可以释放大量被意外捕获在核颗粒中的较小物质，但这一过程确实有造成核破坏的风险。
6．将PNS应用于梯度，省略这一步，并将PNS与等体积的溶液D混合。
7．较大体积的转子(如贝克曼SW28或SW28.1)具有相似的管长度，离心条件不需要修改。对于较小体积的转子(例如贝克曼SW55Ti)，可以在133,000g下进行5 h离心。
相关产品推荐
其他细胞品类
别划走，精彩继续
长按识别
添加一对一专属技术支持
扫码进群
咨询详细产品信息
点在看，传递你的品味
