【Genovis】FabRICATOR，IgG特异性半胱氨酸蛋白酶

FabRICATOR（IdeS）是一种IgG特异性半胱氨酸蛋白酶，可消化铰链下方单个氨基酸位点的抗体，产生均质的F（ab’）2和Fc片段。酶是广泛用于基于抗体的疗法（如单克隆抗体、ADC、生物仿制药和Fc融合蛋白）的表征、质量控制、稳定性测试、生产监测和克隆选择。

◆◆人 IgG1-4，IgG（猴子的一些类，鼠、兔子、绵羊）

◆◆CPAPELLG / GPSVF

◆◆反应时间为30分钟

◆◆无需还原剂或辅助试剂

FabRICATOR酶消化抗体，在37°C下30分钟内产生完整的F（ab’）2和Fc亚基，无需优化，没有过度消化的风险，然而，常见的蛋白酶，如木瓜蛋白酶，非蛋白酶或胃蛋白酶则会过度消化。

对于抗体亚基LC-MS工作流程中的样品制备，亚基可以降解产生23-25 kDa片段，因此提高质谱的分辨率，用于准确确定关键质量属性。

使用FabRICATOR生成的均质片段，再单同位素化，以便深入解析可能在完整级别无法解析的属性。该工作流程可用于氨基酸序列验证和质量属性的氧化分析，包括脱酰胺，焦谷氨化和聚糖分析。相对丰度为11个Fc聚糖的治疗性抗体，经FabRICATOR消化后定量分析，可提高质谱分辨率，并且不需要其他类似方法要求的额外的消化或标记工作。

将抗体消化成均质亚基进行分析，可以快速监测在储存和配制过程中可能发生的变化，如蛋氨酸氧化。用FabRICATOR对经过强制氧化的治疗性抗体进行特异性酶切，通过GlycINATOR进行脱糖基化并在亚基水平上进行分析。氧化分析获得了具体数据，如Fc/2片段的反卷积质谱所示。分析通量高。

适用于需要快速方便地消化抗体的应用，或制备无残留酶的Fc融合蛋白，FragIT小柱装填有固定在琼脂糖珠上的FabRICATOR。使用FragIT试剂盒，均匀的F（ab’）2和Fc片段也可以使用CaptureSelect™亲和纯化柱进行分离。

参考文献

Ayoub，D. et al.，2013.西妥昔单抗的正确一级结构评估和广泛的糖谱分析，具体做法如下：

完整的，中上，中下和自下而上的ESI和MALDI质谱技术。mAbs，5（5），pp.699–710.

FabRICATOR-HPLC是将FabRICATOR酶固定在与HPLC兼容的树脂上，用于一致的和可重复性柱上抗体消化。

FabRICATOR-HPLC色谱柱可以用于标准的LC-MS常规分析；也可以是更先进的配置，例如2D-LC配置；最先进的是将生物反应器与MS连接为一个系统，该系统可以自动化在线进行柱上消化，抗体亚基分析，这将大大减少操作人员时间、样品处理误差，并增加样品通量。

该工作流程可消化IgG 至 F（ab’）2 和 Fc，非常适合高分辨率 MS 分析。

柱上消化效率测试是由 FabRICATORHPLC 在 37°C 下进行高达 14 天连续工作测试，其中 2 μg曲妥珠单抗每4小时注射一次，并且由LC-MS分析。生成的抗体片段是在色谱柱上进行降解并自动分析，14天内超过 95 % 抗体被消化降解。

FabRICATOR-HPLC的性能测试。

采用标准FabRICATOR 消化的（橙色图）与使用FabRICATOR-HPLC自动化消化的（蓝色图）的比较，以及14天内自动化消化的定量分析（底图）。

*是一个轻链片段，非完全还原，分子内有一个完整的二硫键。

使用FabRICATOR-HPLC 色谱柱分析曲妥珠单抗Fc糖基化，表明其性能和运行稳定。

自动化使用 FabRICATOR-HPLC 进行亚基分析的质谱与通过标准的FabRICATOR消化的分析结果没有明显区别。Fc糖基化效果稳定且连续 14 天可重复，所有糖型的标准偏差均小于0.5%。

使用FabRICATOR-HPLC进行聚糖分析

曲妥珠单抗 Fc/2的反卷积质谱，标准 FabRICATOR消解的（上图，橙色），FabRICATOR-HPLC消解的（上图，蓝色），糖基化曲妥珠单抗（下图，橙色，n=10）或（下图，蓝色，n=28）。

用于抗体的自动化处理。FabRICATOR MagIC 包含固定在磁性琼脂糖珠上的FabRICATOR酶。磁性方式支持并行样品制备和多种抗体亚基的分析。它适用于手动或自动的基于IgG的生物制剂的常规分析。

FabRICATOR MagIC 用于Thermo Scientific KingFisher™纯化系统的工作流程 根据Thermo Scientific KingFisher™工作流程，IgG、FabRICATOR MagIC和 PBS 被转移到96深孔板。将磁珠（1）转移到含有PBS的孔中，用于（2）平衡和（3）收集。将磁珠（4）加入样品中，在37°C下（5）孵育10-20分钟，然后（6）收集，纯F（ab’）2和Fc会留在孔板中（7）。KingFisher商标属于Thermo Fisher Scientific。

使用FabRICATOR MagIC 生成完整的F（ab’）2和Fc亚基，使用5 mM TCEP降解二硫键。生成的 Fc/2、LC 和 Fd’ 片段可以使用进行分析和监控；与完整的抗体水平分析方法相比，分辨率更好。

使用FabRICATOR MagIC 处理抗体产生的片段，经反相LC-MS分析显示抗体被完全消化。

用FabRICATOR MagIC生成抗体亚基。通过 RPLC-MS 在完整水平（上图）下分析单克隆抗体，之后使用FabRICATOR MagIC消化（中图）和用FabRICATORMagIC和5 mM TCEP（底图）处理后。数据是通过与Symphogen A / S（Ballerup, 丹麦）协作获得的。

使用FabRICATOR MagIC 实现自动化消化多种mAbs。分析不同的CAQs（Critical Quality Assurance, 关键质量属性），如氧化。

6种不同的mAbs的混合物被强制降解，使用LC-MS在完整或亚基水平分析。结果显示：使用FabRICATOR Magic 可以快速检测和监控复杂的混合的单克隆抗体的修饰。

详细分析Fc-聚糖（mAb经FabRICATORMagic消化和TCEP 5mM还原后生成Fc-聚糖）。

FabRICATOR®

冻干酶用于消化IgG

FabRICATOR® Validation kit

认证包：三个不同批次的 FabRICATOR 酶，用于验证基于 FabRICATOR 的分析方法。

FragIT™

固定化FabRICATOR酶（小柱），用于IgG的消化。

FragIT™ kit

固定化 FabRICATOR 酶和CaptureSelect™ Fc 亲和小柱，用于消化和纯化IgG亚基。

FabRICATOR®-HPLC

在HPLC相容性树脂上固定化的FabRICATOR酶，用于柱上消化。

FabRICATOR® MagIC

磁珠上的固定 FabRICATOR 酶，用于自动化工作流程。