【Genovis】GlyCLICK®，天然IgG特异性位点偶联

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GlyCLICK是一种三步结合技术，用于IgG（几个物种和子类的）的特定位点定量结合。Fc聚糖特异性水解，核心 GlcNAcs在特定位点上使用强大的点击化学共轭，DOL（Degree of Label，标记度)或DAR(antibody-frug ratio, 抗药比)为2.0。可靠的性能保证了定量共轭和敏感应用的完整免疫反应性。一系列试剂盒采用该技术。

◆◆人 IgG1-4，IgG（老鼠，兔子，老鼠，猴子，绵羊、山羊、牛和马）

◆◆共轭发生在Fc N-聚糖位点

◆◆2-3天标准工作流程

◆◆Alexa Fluor®, 生物素,DFO, MMAE, PNU,叠氮化物活化

偶联工作流程

去糖基化：Fc 特异性内糖苷酶GlycINATOR（EndoS2）水解IgG（几个种类和子类）Fc聚糖到最里面GlcNAc 部分。酶去除所有糖型，包括高甘露糖，杂交，复杂和二分聚糖。

叠氮化物活化：GalNAz经酶促连接在暴露的GlcNAc上：使用 β-1，4-半乳糖基转移酶（Y289L） 1和UDP-GalNAz，以产生叠氮化物激活的抗体，与环辛炔-功能化标记物（例如 sDIBO 或 DBCO反应性标记物）反应。

点击反应：叠氮化激活的抗体与环辛炔功能化标记物偶联：通过生物正交（bioorthogonal）反应，使用Strain促进的无铜参与的选择性的点击化学物质SPAAC（strain-promoted alkyne azidecycloaddition），形成稳定的三氮唑偶联共价物。

产品形式

使用GlyCLICK®的新一代抗体偶联物

传统上使用随机策略进行偶联：通过标记赖氨酸残基上的可用胺或溶剂可达的链间半胱氨酸。尽管这种方法是通用的，但对标记程度和位置的控制有限，因此容易影响最终产品的稳定性、免疫反应性和重现性。特定位点的策略已经成为克服这些限制的一个有吸引力的选择，但往往需要基因工程来控制和稳定的过程。使用GlyCLICK在Fc聚糖位点上结合，不仅具有位点特异性，而且通过破坏与免疫细胞Fc受体(Fcγ rs)的结合，降低了IgG的脱靶效应。

使用GlyCLICK®为不同应用定制标记物

酶重构和无铜点击化学(SPAAC)的结合使GlyCLICK能够使用任何环辛烷标签(如sDIBO或DBCO标签)进行特定位点偶联抗体。为了证明使用GlyCLICK获得的材料均质性，帕尼珠单抗与不同标签结合，并通过RP-HPLC在F(ab’)2和Fc/2亚基水平上进行分析。结果分离显示，与天然（Native）对应物相比，仅检测到标记的Fc/2亚基的保留变化，表明GlyCLICK特异性结合在Fc聚糖位点。

使用GlyCLICK分析Fc聚糖偶联。RP-HPLC分析用FabRICATOR消化后的未修饰帕尼单抗和帕尼单抗（偶联去铁沙明(DFO)，Alexa Fluor®488, 生物素或单甲基奥瑞司汀 E (MMAE))。

1. SiteClick™ 是由Life Technologies Corporation的知识产权授权提供的。商标SiteClick。是Life Technologies Corporation的财产。

2. GlyCLICK®中包含的linker-toxin Payloads（毒素连接载荷）均根据Glykos芬兰有限公司的知识产权许可提供。

使用GlyCLICK®进行可靠的抗原检测

使用随机标记的抗体进行免疫染色，由于过度标记或来自抗原结合Fab区标记的免疫反应性受损，导致信号不足和非特异性结合，从而影响图像质量。为了评估标记后的免疫反应性，使用GlyCLICK将曲妥珠单抗特定位点偶联到Alexa Fluor®488，或使用NHS激活的DyLight®488在赖氨酸上随机标记。表面等离子体共振(Surface plasmon resonance, SPR)反应曲线显示，随机标记的材料只有20%的结合能力保持不变，而GlyCLICK标记的抗体则完全保持了免疫反应性，可进行敏感可靠的检测。

GlyCLICK®偶联抗体的细胞内性能

使用特定位点GlyCLICK技术放射标记的抗体或通过赖氨酸随机偶联产生的抗体用于PET/CT成像，以评估其体内性能。螯合后，用标准放射性同位素锆-89 (89Zr)标记示踪剂，然后注射到荷瘤小鼠体内。使用PET/CT成像对注射小鼠进行分析，以测量示踪剂的生物分布和肿瘤摄取。结果显示，与随机标记的示踪剂相比，特定位点的GlyCLICK示踪剂具有更好的肿瘤摄取能力和更长的循环时间。使用GlyCLICK试剂盒，每个抗体偶联的标签数量一致(DOL = 2)，不仅提高了体内性能，还可以在PET成像实验中进行更好的定量。

使用GlyCLICK®ADC试剂盒生产高效ADCs

GlyCLICK ADC试剂盒用于将任何天然抗体与携带MMAE或PNU毒素的可切割连接的两步载荷结合。特定位点ClyCLICK技术可实现完全偶联，将连接载荷与抗体结合，DAR为2.0。该试剂盒生成均质ADCs（采用切割连接两步载荷），用于细胞内药物释放，并生成在pM范围内具有细胞毒性的偶联物，表明ADC功能性强和能量大。