【ScienCell】人睾丸内皮细胞（HTEC）产品使用攻略

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小白求助前辈指路

人睾丸内皮细胞培养不成功、实验做不出来怎么办？新手小白迫切求助，希望各位前辈在文章下方留言，分享自己的经验，为小白们答疑解惑！

人睾丸内皮细胞

（HTEC）

睾丸内皮细胞（TEC）位于中肾，在胚胎发育过程中从中肾迁移至睾丸，在睾丸索形成过程中起着重要作用。迁移的内皮细胞通过为Sertoli和Germ细胞创建分区来启动导管的形成。研究表明睾丸内皮细胞具有类似于脑内皮细胞的特性，并有助于建立血-睾丸屏障（BTB）。培养HTEC可应用于研究睾丸发育异常中的血管缺陷机制，可能为治疗男性生殖障碍提供新的见解。

HTEC分离自人睾丸，可提供过vWF/Factor VIII和CD31 (PECAM1)特异性抗体免疫荧光染色进行鉴定。

培养方式

培养瓶：纤连蛋白（Bovine Plasma Fibronectin, 2 µg/cm²）包被培养瓶。

培养基：HTEC用提供的ECM完全培养基（包含基础培养基、1% ECGS、1% P/S）培养。

操作步骤

1) 包被纤连蛋白（2 µg/cm²）培养瓶的准备（T-75培养瓶）：将10 mL无菌的Dulbecco's磷酸盐缓冲盐（DPBS）与150 µL纤连蛋白原液混匀后加入到T-75培养瓶中，将培养瓶放置在37°C的孵育箱中过夜（或至少2小时）。在铺细胞前将未凝固纤连蛋白溶液吸出（可重复使用2次），加入20 mL ECM完全培养基（基础培养基、ECGS和P/S按比例混合配制）。

2) 吸出未凝固的纤连蛋白溶液，T-75中加入20 mL的完全培养基，将解冻后的细胞小心加入到培养基中，十字交叉法轻柔平晃培养瓶。（注：不建议在解冻后对细胞进行稀释和离心，因为这些与培养物中残留DMSO的作用相比，这些作用对细胞的损伤更大；将HTEC置于纤连蛋白包被的培养瓶中，促进生长同样重要。）

换液：培养开始后16小时内不要干扰培养。次日更换培养液，去除残留的DMSO和未贴壁细胞。之后每三天更换一次培养基，直到培养达到大约70%的密度。一旦培养达到大约70%的密度，每隔一天更换一次培养基，直到培养达到大约90%的密度。

传代：当细胞密度达到90%时进行传代。

1) 将T/E、包被培养瓶、DPBS、培养基提前置于室温平衡（不建议37℃加热）。

2) 弃除旧培养基，并用DPBS清洗细胞后吸除加入8 mL DPBS和2 mL 0.05% T/E solution 轻柔晃动培养瓶后放入37℃培养箱（注：原代细胞传代时请勿使用未稀释的胰蛋白酶），一段时间后镜下观察，待细胞完全变圆、脱落，轻轻拍打底部和侧面，加入2 mL FBS，将细胞悬液转移至15 mL离心管中，1000 rpm离心5 min，用新培养基重悬细胞沉淀后计数，根据5000-7000 cells/cm²的密度传代至预先用纤连蛋白包被的培养瓶中。

生长条件

在CO₂浓度为5%，温度为37℃，相对湿度（RH）为95%的细胞培养箱中培养。

表 1 HTEC培养材料

参考文献

[1] Combes A, Wilhelm D, Davidson T, Dejana E, Harley V, Sinclair A, Koopman P. (2009) “Endothelial cell migration directs testis cord formation.” Dev Biol. 326(1): 112-120.

[2] Coveney D, Cool J, Oliver T, Capel B. (2008) “Four-dimensional analysis of vascularization during primary development of an organ, the gonad.” Proc Natl Acad Sci. 105(20): 7212-7217.

[3] Holash J, Harik S, Perry G, Stewart P. (1993) “Barrier properties of testis microvessels.” Proc Natl Acad Sci. 90: 11069-11073.

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