【ScienCell】人牙周韧带成纤维细胞（HPLF）产品使用攻略

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人原代细胞 Human Primary cells 口腔细胞系统 Oral Cell System Sciencell 人牙周韧带成纤维细胞 Periodontal Ligament Fibroblasts Fibroblast Medium 2301

小白求助前辈指路

人牙周韧带成纤维细胞培养不成功、实验做不出来怎么办？新手小白迫切求助，希望各位前辈在文章下方留言，分享自己的经验，为小白们答疑解惑！

人牙周韧带成纤维细胞

（HPLF）

牙周膜是位于牙齿的牙骨质和下颌骨的牙槽骨之间的结缔组织。在牙周组织的维持和再生中发挥着不可或缺的作用。负责维持这种组织的细胞被认为是成纤维细胞，它可以是多能的或由功能不同的异质性细胞群组成。尽管与牙龈成纤维细胞形态相似，牙周膜成纤维细胞（periodontal ligament fibroblasts，PLF）在维持组织完整性方面表现出不同的功能活性。PLF可产生成骨细胞相关的细胞外基质蛋白，与牙龈成纤维细胞相比表现出更高的碱性磷酸酶活性。PLF积极参与牙周病中的免疫和炎症事件。

HPLF分离自人牙周组织，呈纺锤型，其fibronectin特异性抗体免疫荧光染色呈阳性。

培养方式

培养瓶：PLL（多聚-L-赖氨酸）包被培养瓶。

培养基：HPLF用提供的FM完全培养基（包含基础培养基、2% FBS、1%FGS和1% P/S）培养。

操作方法

1) 包被PLL（2 μg/cm²）培养瓶（T-75培养瓶）的准备：将10 mL无菌水加入到T-75培养瓶中，加入15 μL PLL原液，轻轻吹匀后将培养瓶放置在37°C的孵育箱中过夜（或至少1小时）。

2) 无菌水清洗包被PLL的T-75 2次，加入20 mL FM完全培养基（基础培养基、FBS、FGS和P/S按比例混合配制），将解冻后的HPLF加入至包被的T-75中，十字交叉法轻柔摇晃培养瓶使细胞分布均匀，将培养瓶放入细胞培养箱中。（注：不建议在解冻后稀释和离心细胞，因为这些操作对细胞的伤害比培养中残留的二甲基亚砜（DMSO）的影响更大。同时，细胞在PLL包被培养瓶中有助于促进细胞附着。）

换液：为了获得最佳结果，在培养开始后至少16小时内不要干扰培养。第二天更换培养基，以去除残留的二甲基亚砜和未附着的细胞，之后每隔三天更换一次培养基，直到培养达到约70%的密度，一旦培养达到约70%的密度，每隔一天更换一次培养基，直到培养达到约90%的密度。

传代：当细胞密度达到95%时进行传代。

1) 将T/E、包被培养瓶、DPBS、培养基提前置于室温平衡（不建议37℃加热）。

2) 弃除旧培养基，并用DPBS清洗细胞后吸除加入5 mL DPBS和5 mL 0.05% T/E solution 轻柔晃动培养瓶后放入37℃培养箱（注：原代细胞传代时请勿使用未稀释的胰蛋白酶），一段时间后镜下观察，待细胞完全变圆、脱落，轻轻拍打底部和侧面，加入2 mL FBS终止消化，将细胞悬液转移至15 mL离心管中，1000 rpm离心5 min，用新培养基重悬细胞沉淀后计数，根据5000 cells/cm²的密度传代至预先用PLL包被的培养瓶中。

生长条件

在CO₂浓度为5%，温度为37℃，相对湿度（RH）为95%的细胞培养箱中培养。

表 1 HPLF培养材料

参考文献

[1] Han X, Amar S. (2002) “Identification of genes differentially expressed in cultured human periodontal ligament fibroblasts vs. human gingival fibroblasts by DNA microarray analysis.” J Dent Res. 81(6):399-405.

[2] Murakami Y, Kojima T, Nagasawa T, Kobayashi H, Ishikawa I. (2003) “Novel isolation of alkaline phosphatasepositive subpopulation from periodontal ligament fibroblasts.” J Periodontol. 74(6):780-6.

[3] Takashiba S, Naruishi K, Murayama Y. (2003) “Perspective of cytokine regulation for periodontal treatment: fibroblast biology.” J Periodontol. 74(1):103-10.

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