【ScienCell】人肾小球内皮细胞（HRGEC）产品使用攻略
人肾小球内皮细胞培养不成功、实验做不出来怎么办？新手小白迫切求助，希望各位前辈在文章下方留言，分享自己的经验，为小白们答疑解惑！
人肾小球内皮细胞
（HRGEC）
肾小球内皮细胞（GEC）是参与肾小球超滤调节的一种特殊的微血管细胞，构成滤过屏障的内部部分，参与肾小球内的病理生理过程。GEC组成性地产生生物活性分子，可被炎症和血栓性分子放大。严重的肾小球病变引起的内皮细胞损伤可抑制血管生成，并导致损伤部位的硬化。GEC损伤影响系膜细胞和上皮细胞，导致肾脏疾病的进展。由于这些细胞的培养、克隆和繁殖困难，GEC的生物学特性在很大程度上仍然未知。HRGEC的vWF/Factor VIII和CD31 (PECAM1)特异性抗体免疫荧光染色呈阳性。
培养方式
培养瓶：纤连蛋白（Bovine Plasma Fibronectin, 2 µg/cm2）包被培养瓶。
培养基：HRGEC用提供的ECM完全培养基培养（包含基础培养基、5% FBS、1% ECGS和1% P/S）。
操作步骤：
1) 包被纤连蛋白（2 µg/cm2）的培养瓶的准备（建议使用T-75培养瓶）：将5 mL无菌的Dulbecco's磷酸盐缓冲盐（DPBS）与150 µL纤连蛋白原液混匀后加入到T-75培养瓶中，将培养瓶放置在37°C的孵育箱中过夜（或至少2小时）。在铺细胞前将未凝固纤连蛋白溶液吸出（可重复使用2次），加入20 mL ECM完全培养基培养（基础培养基、FBS、ECGS和P/S按比例混合配制）。
2) 将解冻后的细胞加入至T-75中，十字交叉法平晃培养瓶使细胞均匀分布，置于细胞培养箱中培养。
换液：培养开始后至少16小时内不要干扰培养。第二天更换培养基，以去除残留的二甲基亚砜和未附着的细胞，此后每三天更换一次培养基，直到培养物达到大约70%的汇聚度。一旦培养物达到70%的汇聚度，每隔一天更换一次培养基，直到培养物达到大约90%的汇聚度，及时将细胞用于实验。
传代：当细胞密度达到90%时进行传代。
1) 将T/E、包被培养瓶、DPBS、培养基提前置于室温平衡（不建议37℃加热）。
2) 弃除旧培养基，并用DPBS清洗细胞后吸除加入8 mL DPBS和2 mL 0.05% T/E solution 轻柔晃动培养瓶后放入37℃培养箱（注：原代细胞传代时请勿使用未稀释的胰蛋白酶），一段时间后镜下观察，待细胞完全变圆、脱落，轻轻拍打底部和侧面，加入1 mL FBS，将细胞悬液转移至15 mL离心管中，1000 rpm离心5 min，用新培养基重悬细胞沉淀后计数，根据5000-7000 cells/cm2的密度传代至预先用Bovine Plasma Fibronectin包被的培养瓶中。
生长条件：在CO2浓度为5%，温度为37℃，相对湿度（RH）为95%的细胞培养箱中培养。
表 1 HRGEC培养材料
参考文献
[1] Nangaku M, Shankland SJ, Couser WG, and Johnson RJ. (1998) “A new model of renal microvascular injury.” Curr Opin Nephrol Hypertens. 7(4):457-62.
[2] Kester M, Nowinski RJ, Holthofer H, Marsden PA, Dunn MJ. (1994) “Characterization of platelet-activating factor synthesis in glomerular endothelial cell lines.” Kidney Int. 46(5):1404-12.
[3] Lee LK, Meyer TW, Pollock AS, Lovett DH. (1995) “Endothelial cell injury initiates glomerular sclerosis in the rat remnant kidney.” J Clin Invest. 96(2):953-64.
[4] Yamanaka N, Shimizu A. (1999) “Role of glomerular endothelial damage in progressive renal disease.” Kidney Blood Press Res. 22(1-2):13-20.
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