【Lonza】人表皮黑色素细胞(HEM)产品使用攻略

黑色素细胞是神经嵴来源的细胞，通过黑色素合成产生黑色素。黑色素细胞分布在多个组织中，包括表皮、眼睛、内耳和软脑膜。在胚胎发育过程中，黑色素细胞的迁移、增殖或存活的失调会导致这些组织的先天性疾病，如Tietz综合征、Waardenburg综合征和斑块状白癜风。在皮肤表皮的底层，黑色素细胞合成并将深色黑色素转移给周围的角质细胞，赋予皮肤色素，同时合成的黑色素能阻挡UV-B光线，保护真皮免受太阳照射引起的光损伤。HEM可应用于研究黑色素瘤、内耳稳态、白癜风和杜兴氏肌萎缩症中的线粒体功能障碍。HEM的S100β和NGF-receptor (p75)特异性抗体免疫荧光染色呈阳性。

黑色素细胞培养通过Mel-5（gp75/TRP-1）的免疫荧光标记来检测纯度，并通过确认L-Dopa转化活性来测试其功能表现。

培养基：用提供的完全培养基（包含Basal Medium和补充剂）培养。

操作步骤

1) 完全培养基的配制：将室温融化的补充剂用移液器上下轻柔混匀，并全部加入到Basal Medium中并混合均匀（可加入适量的培养基至补充剂的管中并用移液器上下冲洗，以确保补充剂全部转移至基础培养基中，在10%以内的补充剂损耗不会影响细胞的生长），4℃避光保存（1个月内用完，禁止反复冻融）。

2) 复苏细胞前，将10 ml完全培养基置于T-25并置于细胞培养箱中平衡至少30min。将冻存细胞置于37℃水浴中融化（时间不超过2 min）后用酒精消毒。用移液器将细胞转移至预热的T-25中。

换液：在培养开始后至少16小时内不要干扰培养。第二天更换培养基，以去除残留的二甲基亚砜和未附着的细胞，之后每隔三天更换一次培养基。

传代：当细胞密度70%~90%时进行传代。

1) 将T/E、PBS、EDTA（0.02%）、TNS和培养基提前置于室温平衡（不建议37℃加热）。

2) 弃除旧培养基，并用PBS清洗细胞。加入1 ml EDTA（0.02%）与1 ml Trypsin-EDTA的混合液并覆盖细胞层（暴露于较高浓度的Trypsin-EDTA将损伤黑色素细胞）。在室温下孵育30-60 sec，显微镜下观察，一旦超过90%的细胞变圆并脱离（轻拍培养瓶或培养皿可以加速细胞脱离），将培养瓶竖立，加入预热的2 ml预热的TNS，用移液管在细胞层表面多次吸液，使溶液均匀分散并将细胞悬液转移至15mL离心管中。若2 min内仍有大部分细胞贴壁，用TNS终止消化（Trypsin孵育时间过长将损伤黑色素细胞），将脱落细胞转移至离心管后，重新加入预热的Trypsin-EDTA继续进行消化并重复上一步。向T-25中加入2mL MGM™-4完全培养基收集残留的细胞，并转移至离心管中。显微镜下观察是否有细胞残留（应小于5%）以确保细胞收集成功。

3) 不要将收集的黑色素细胞悬液离心！

4) 对活细胞进行计数。用MGM™-4 完全培养基将细胞稀释至合适的密度（cells/mL）接种至培养皿并置于细胞培养箱中，第二天换液，并此后每隔一天换液一次。随着细胞数量的增加，培养基体积按按以下方式换液：细胞汇合度25%以下按1 mL /5 cm² 换液；汇合度达到25%-45%按1.5 mL /5 cm²换液；汇合度超过45%，按2 mL/5 cm²换液。

生长条件

在CO₂浓度为5%，温度为37℃，相对湿度（RH）为95%的细胞培养箱中培养。

表 1  HEM培养材料

参考文献

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[2] Neng L, Zhang F, Kachelmeier A, Shi X. (2013) “Endothelial cell, pericyte, and perivascular resident macrophage-type melanocyte interactions regulate cochlear intrastrial fluid-blood barrier permeability.” J Assoc Res Otolaryngol. 14: 175-85.

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