【Lonza】人表皮角质形成细胞（HEK）产品使用攻略

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表皮角质形成细胞 HEK 人原代细胞 Human Primary cells 皮肤细胞系统 Dermal Cell System Lonza Epidermal Keratinocytes Basal Medium Gold Keratinocyte Growth Medium 00192151 00192060

小白求助前辈指路

人表皮角质形成细胞培养不成功、实验做不出来怎么办？新手小白迫切求助，希望各位前辈在文章下方留言，分享自己的经验，为小白们答疑解惑！

人表皮角质形成细胞

（HEK）

皮肤的表皮层在抵御外界环境的侵害方面提供了重要的保护屏障功能。表皮中的主要细胞类型是角质细胞，它们位于分层鳞状上皮组织中。角质细胞是以角蛋白命名的，角蛋白是该细胞中最丰富的蛋白质。角质细胞的祖细胞位于表皮的基底层，进行分裂，然后会分化并向表皮表面迁移，最终永久退出细胞周期。角质细胞的增殖、分化和程序性细胞死亡是复杂而精心协调的过程。除了其保护功能外，角质细胞还表达粘附分子和细胞因子，在皮肤先天免疫、组织稳态、伤口愈合、肿瘤发展发挥重要作用。HEK分离自成人皮肤，其cytokeratin-18和cytokeratin-19的特异性抗体免疫荧光染色呈阳性。

HEK培养方式

培养基：用提供的完全培养基（包含Basal Medium和补充剂）培养。

操作步骤：

1) 完全培养基的配制：将室温融化的补充剂用移液器上下轻柔混匀，并全部加入到Basal Medium中并混合均匀（可加入适量的培养基至补充剂的管中并用移液器上下冲洗，以确保补充剂全部转移至基础培养基中，在10%以内的补充剂损耗不会影响细胞的生长），4℃避光保存（1个月内用完，禁止反复冻融）。

2) 复苏细胞前，将10 ml完全培养基置于T-25并置于细胞培养箱中平衡至少30min。将冻存细胞置于37℃水浴中融化（时间不超过2 min）后用酒精消毒。用移液器将细胞转移至预热的T-25中。

换液：在培养开始后至少16小时内不要干扰培养。第二天更换培养基，以去除残留的二甲基亚砜和未附着的细胞，之后每隔三天更换一次培养基。

传代：当细胞密度70%~90%时进行传代。

1) 将T/E、HEPES、TNS和培养基提前置于室温平衡（不建议37℃加热。

2) 弃除旧培养基，并用HEPES（或等效的无钙镁平衡盐溶液）清洗细胞后吸除，加入2 ml Trypsin-EDTA溶液覆盖细胞层。在室温下孵育2-6 min,显微镜下观察，如果细胞未有90%以上脱离，继续孵育并每30 sec观察一次（孵育细胞时间不要超过7 min）。一旦超过90%的细胞变圆并脱离（轻拍培养瓶或培养皿可以加速细胞脱离），将培养瓶竖立，加入预热的4 ml预热的TNS。用移液管在细胞层表面多次吸液，使溶液均匀分散，并将细胞悬液转移至15ml离心管中。向T-25中加入2ml HEPES收集残留的细胞，并转移至离心管中。将T-25置于显微镜下观察是否有细胞残留（应小于10%）。220 × g的速度，在室温下离心细胞5 min。去除上清液，获得细胞沉淀。加入2 ml-3 ml预热的完全培养基，重悬细胞沉淀，对活细胞进行计数。按10,000 cells/cm²的细胞密度进行接种。接种后的细胞置于细胞培养箱中进行培养。

生长条件：在CO₂浓度为5%，温度为37℃，相对湿度（RH）为95%的细胞培养箱中培养。

表 1 HEK培养材料

参考文献

[1] Eckert RL, Efimova T, Dashti SR, Balasubramanian S, Deucher A, Crish JF, Sturniolo M, Bone F. (2002) “Keratinocyte survival, differentiation, and death: many roads lead to mitogen-activated protein kinase.” J Investig Dermatol Symp Proc. 7: 36-40.

[2] Song PI, Park YM, Abraham T, Harten B, Zivony A, Neparidze N, Armstrong CA, Ansel JC. (2002) “Human keratinocytes express functional CD14 and toll-like receptor 4.” J Invest Dermatol. 119: 424-32.

[3] de Panfilis G, Semenza D, Lavazza A, Mulder AA, Mommaas AM, Pasolini G. (2002) “Keratinocytes constitutively express the CD95 ligand molecule on the plasma membrane: an in situ immunoelectron microscopy study on ultracryosections of normal human skin.” Br J Dermatol. 147: 7-12.

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