【ScienCell】人表皮角质形成细胞（HEK）产品使用攻略
人表皮角质形成细胞培养不成功、实验做不出来怎么办？新手小白迫切求助，希望各位前辈在文章下方留言，分享自己的经验，为小白们答疑解惑！
人表皮角质形成细胞
（HEK）
皮肤的表皮层在抵御外界环境的侵害方面提供了重要的保护屏障功能。表皮中的主要细胞类型是角质细胞，它们位于分层鳞状上皮组织中。角质细胞是以角蛋白命名的，角蛋白是该细胞中最丰富的蛋白质。角质细胞的祖细胞位于表皮的基底层，进行分裂，然后会分化并向表皮表面迁移，最终永久退出细胞周期。角质细胞的增殖、分化和程序性细胞死亡是复杂而精心协调的过程。除了其保护功能外，角质细胞还表达粘附分子和细胞因子，在皮肤先天免疫、组织稳态、伤口愈合、肿瘤发展发挥重要作用。HEK分离自成人皮肤，其cytokeratin-18和cytokeratin-19的特异性抗体免疫荧光染色呈阳性。
培养方式
培养瓶：PLL（多聚-L-赖氨酸）包被培养瓶。
培养基：HEK用提供的KM完全培养基（包含基础培养基、1% KGS和1% P/S）。
操作步骤：
1) 包被PLL（2 μg/cm2）培养瓶（T-75培养瓶）的准备：将10 mL无菌水加入到T-75培养瓶中，加入15 μL PLL原液，轻轻吹匀后将培养瓶放置在37°C的孵育箱中过夜（或至少1小时）。
2) 无菌水清洗包被PLL的T-75 2次，加入20 mL完全培养基，将解冻后的HEK加入至包被的T-75中，十字交叉法轻柔摇晃培养瓶使细胞分布均匀，将培养瓶放入细胞培养箱中。（注：不建议在解冻后稀释和离心细胞，因为这些操作对细胞的伤害比培养中残留的二甲基亚砜（DMSO）的影响更大。同时，将细胞置于PLL涂层培养有助于促进细胞附着。）
换液：为了获得最佳结果，在培养开始后至少16小时内不要干扰培养。第二天更换培养基，以去除残留的二甲基亚砜和未附着的细胞，之后每隔三天更换一次培养基，直到培养达到约70%的密度，一旦培养达到约70%的密度，每隔一天更换一次培养基，直到培养达到约90%的密度。
传代：当细胞密度达到90%时进行传代。
1) 将T/E、DPBS、培养基提前置于室温平衡（不建议37℃加热）。
2) 弃除旧培养基，并用DPBS清洗细胞后吸除，加入5 mL DPBS和5 mL 0.05% T/E solution 轻柔晃动培养瓶后放入37℃培养箱，一段时间后镜下观察，待细胞完全变圆、脱落，轻轻拍打底部和侧面，加入2 mL FBS（#0500）终止消化，将细胞悬液转移至15 mL离心管中，1000 rpm离心5 min，用新培养基重悬细胞沉淀后计数，根据5000 cells/cm2的密度传代至预先用PLL包被的培养瓶中。
生长条件：在CO2浓度为5%，温度为37℃，相对湿度（RH）为95%的细胞培养箱中培养。
表 1 HEK培养材料
参考文献
[1] Eckert RL, Efimova T, Dashti SR, Balasubramanian S, Deucher A, Crish JF, Sturniolo M, Bone F. (2002) “Keratinocyte survival, differentiation, and death: many roads lead to mitogen-activated protein kinase.” J Investig Dermatol Symp Proc. 7: 36-40.
[2] Song PI, Park YM, Abraham T, Harten B, Zivony A, Neparidze N, Armstrong CA, Ansel JC. (2002) “Human keratinocytes express functional CD14 and toll-like receptor 4.” J Invest Dermatol. 119: 424-32.
[3] de Panfilis G, Semenza D, Lavazza A, Mulder AA, Mommaas AM, Pasolini G. (2002) “Keratinocytes constitutively express the CD95 ligand molecule on the plasma membrane: an in situ immunoelectron microscopy study on ultracryosections of normal human skin.” Br J Dermatol. 147: 7-12.
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