【Lonza】人真皮淋巴内皮细胞（HDLEC）产品使用攻略
人真皮淋巴内皮细胞培养不成功、实验做不出来怎么办？新手小白迫切求助，希望各位前辈在文章下方留言，分享自己的经验，为小白们答疑解惑！
人真皮淋巴内皮细胞
（HDLEC）
淋巴系统是免疫系统的重要组成部分，与血管系统在维持组织稳态方面具有明确但互补的功能，包括间质蛋白质转运、组织液平衡、压力平衡和细胞免疫的发展。淋巴毛细血管牢固地融入间质，通过细小的弹性纤维束与细胞外基质连接，将组织中的多余液体运输到循环系统中，并由于缺乏连续的基底膜，具有高渗透性。原代人皮肤淋巴内皮细胞（HDLEC）是人皮肤内皮细胞的一个亚群，虽与血管内皮细胞具有众多共同特性，但它们具有反映特定功能的独特结构特征，其中，淋巴内皮细胞通常含有许多内陷和细胞质囊泡，以及特征性的重叠细胞间连接。淋巴内皮细胞参与淋巴系统的病理变化，并是肿瘤微环境的重要组成部分，在肿瘤淋巴血管生成过程中，淋巴内皮细胞构建新的血管，渗入肿瘤，促进肿瘤细胞的转移。HDLEC的vWF、podoplanin、CD31和Lyve1特异性抗体免疫荧光染色呈阳性。
HDLEC培养方式
Human Dermal Microvascular Endothelial Cells（# CC-2543）分离自正常人皮肤组织，是血管和淋巴内皮细胞的混合群体。
培养基：用提供的完全培养基（包含Basal Medium和5% FBS及其他补充剂）培养。
操作步骤：
1) 完全培养基的配制：将室温融化的补充剂用移液器上下轻柔混匀，并全部加入到Basal Medium中并混合均匀，4℃避光保存。
2) T-25中加入10 mL完全培养基。在细胞播种前，在细胞培养箱中预平衡至少30 min。将解冻后的细胞转移到预热的完全培养基中，并置于细胞培养箱中培养。
换液：在培养开始后至少16小时内不要干扰培养。第二天更换培养基，以去除残留的二甲基亚砜和未附着的细胞，之后每隔三天更换一次培养基。（传代至单层细胞需要5-9天）
传代：当细胞密度70%~90%时进行传代。
1) 将T/E、HEPES、TNS和培养基提前置于室温平衡（不建议37℃加热）。
2) 弃除旧培养基，并用HEPES清洗细胞后吸除，加入2.5 mL Trypsin/EDTA溶液。室温下分离细胞，用显微镜检查细胞。当超过90%的细胞开始脱落时，轻轻敲击容器的侧面以松动剩余的细胞，加入5 mL TNS并轻轻摇动，小心地吸取细胞悬浮液并转移到15 mL离心管中。以300×g的速度离心细胞5 min。弃掉上清液，加入1 mL完全培养基，并通过小心地上下吸移来重悬细胞。按3500 cells/cm2接种密度将细胞分装到预先预热至37°C的含完全培养基的培养瓶（1 ml/5 cm2的量添加培养基），或根据实验设计安排种植密度，并放入培养箱中培养，每两到三天更换培养基。
生长条件：在CO2浓度为5%，温度为37℃，相对湿度（RH）为95%的细胞培养箱中培养。
表 1 HDLEC培养材料
参考文献
[1] Swartz A, Skobe M. (2001) “Lymphatic function, lymphangiogenesis, and cancer metastasis.” Microsc Res Tech. 55:92-9.
[2] Leak LV. (1970) “Electron microscopic observations on lymphatic capillaries and the structural components of the connective tissue-lymph interface.” Microvasc Res. 2: 361-91.
[3] Podgrabinska S, Braun P, Velasco P, Kloos B, Pepper M, Jackson D, Skobe M. (2002) “Molecular characterization of lymphatic endothelial cells.” PNAS. 99: 16069-74.
[4] Ji RC. (2006) “Lymphatic endothelial cells, tumor lymphangiogenesis and metastasis: New insights into intratumoral and peritumoral lymphatics.” Cancer Metastasis Rev. 25: 677-94.
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