【ScienCell】人脑微血管内皮细胞（HBMEC）产品使用攻略

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小白求助前辈指路

人脑微血管内皮细胞培养不成功、实验做不出来怎么办？新手小白迫切求助，希望各位前辈在文章下方留言，分享自己的经验，为小白们答疑解惑！

人脑微血管内皮细胞

HBMEC）

脑微血管内皮细胞（BMEC）是血脑屏障的主要组成部分，限制溶质和细胞物质从血液进入脑部。BMEC具有与外周内皮细胞不同的独特特征，例如：1）细胞间紧密连接具有高电阻和慢速的细胞间通量，2）无腔隙和低的胞饮作用水平，以及3）非对称定位的酶和载体介导的转运系统。与外周内皮细胞类似的是，BMEC在其表面表达或可诱导表达细胞粘附分子，调节白细胞进在脑部的渗出。由于其独特的功能，BMEC已被广泛用于研究血脑屏障的分子和细胞特性，HBMEC的vWF和CD-31 (PECAM1)特异性抗体免疫荧光染色呈阳性。

培养方式

HBMEC细胞非常敏感，不会在培养中多次增殖。在解冻细胞前，实验应做好安排。建议在最初培养时尽快使用HBMEC进行实验，并尽量减少细胞的扩增。不建议对其进行细胞传代，但如果不可避免需要传代，需注意以下说明，并仅可传代一次。

培养瓶：包被纤连蛋白涂层的培养瓶（Bovine Plasma Fibronectin，2 µg/cm²）上进行培养，以增强细胞附着和生长。

培养基：HBMEC用提供的ECM完全培养基（包含基础培养基、1% ECGS和1% P/S）培养。

操作步骤：

1)包被纤连蛋白（2 µg/cm²）培养瓶的准备（T-75培养瓶）：将10 mL无菌的Dulbecco's磷酸盐缓冲盐（DPBS）与150 µL纤连蛋白原液混匀后加入到T-75培养瓶中，将培养瓶放置在37°C的孵育箱中过夜（或至少2小时）。在铺细胞前将未凝固纤连蛋白溶液吸出（可重复使用2次），加入20 mL SMCM完全培养基。

2)ECM完全培养基的配制：用移液管将恢复至室温的FBS（#0025）、ECGS补充剂轻轻摇晃后全部转移到基础培养基中，并用培养基清洗补充管以恢复整个体积，然后摇晃以混匀完全培养基。

3)吸出未凝固的纤连蛋白溶液，T-75中加入20 mL的完全培养基，将解冻后的细胞小心加入到培养基中，十字交叉法轻柔平晃培养瓶。（注：不建议在解冻后对细胞进行稀释和离心，因为这些与培养物中残留DMSO的作用相比，这些作用对细胞的损伤更大；将HBMEC置于纤连蛋白包被的培养瓶中，促进生长同样重要。）

换液：培养开始后16小时内不要干扰培养。次日更换培养液，去除残留的DMSO和未贴壁细胞。之后每三天更换一次培养基，直到培养达到大约70%的密度。一旦培养达到大约70%的密度，每隔一天更换一次培养基，直到培养达到大约90%的密度。

传代：当细胞密度达到90%-95%时进行传代。

1)将T/E、DPBS、培养基提前置于室温平衡（不建议37℃加热）。

2)弃除旧培养基，并用DPBS清洗细胞后吸除加入8 mL DPBS和2 mL 0.05% T/E solution 轻柔晃动培养瓶后放入37℃培养箱（注：原代细胞传代时请勿使用未稀释的胰蛋白酶），一段时间后镜下观察，待细胞完全变圆、脱落，轻轻拍打底部和侧面，加入2 mL FBS（#0500）终止消化，将细胞悬液转移至15 mL离心管中，1000 rpm离心5 min，用新培养基重悬细胞沉淀后计数，根据8000-10000 cells/cm²的密度传代至预先用Fibronectin包被的培养瓶中。

生长条件：在CO₂浓度为5%，温度为37℃，相对湿度（RH）为95%的细胞培养箱中培养。

表 HBMEC培养材料