【PromoCell】PromoCell细胞相关问题及解答（二）

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人原代细胞

PromoCell C-12071 HFDPC C-12241 HPMEC

30.什么是“成体干细胞”？

“成体干细胞”是从出生后的组织中分离出来的干细胞，它们保留了细胞更新的能力，同时也能分化为多个细胞系（多能性）。

31.应该将冷冻保存的细胞储存在液氮的液相还是气相中？

原则上，液氮的液相和气相存储都是可接受的，各有其优缺点。液相存储提供了恒定的-196°C温度、较长的保存时间和更大的瓶容量，但存在污染的风险。气相存储在防止污染方面非常安全，但细胞的保持时间较短，瓶容量较小。

32.HFDPC（C-12071）在传代时的最大细胞密度是多少？

HFDPC（C-12071）的细胞密度大约为32,000 - 40,000 cells/cm²（约为800,000 - 1,000,000个细胞每个T25培养瓶）。

33.HPAEC是直接从肺动脉采集的还是这些微血管内皮细胞？

PromoCell的HPAEC（C-12241）是直接从肺动脉中获取的。在分离过程中，从动脉离开心脏的位置开始，包括分叉部位，取出血管。HPAEC代表肺动脉的最内层细胞（即内皮细胞）。PromoCell还提供从外周肺组织的毛细血管中分离得到的肺微血管内皮细胞（HPMEC, C-12281）。

34.如何复苏细胞才能获得高活性细胞？

恢复依赖附着的原代细胞的一般步骤如下：

从液氮中取出小瓶，将其放在干冰上运送到细胞培养实验室。在37°C的水浴中解冻约2 min，直到刚刚解冻。在解冻过程中，保持小瓶浸入水中，直到接近螺纹盖，大约90秒后才短暂地取出来检查进展情况。在使用大量70%乙醇仔细消毒小瓶并转移至层流罩中，将解冻的细胞悬浮液转移到预先在孵育箱中预热30 min以上的相应的细胞培养器皿中。细胞通常在几 h内附着。最迟在24 h内更换培养基，以去除冷冻培养基中的残留二甲基亚砜。更多信息可以在我们细胞的说明书中找到。

35.加入分化培养基（C-23061）后骨骼肌细胞是否分裂？

在添加骨骼肌细胞分化培养基（C-23061）后，肌母细胞将开始分化成肌管，并停止生长。细胞不再分裂。建议在诱导分化之前将骨骼肌细胞悬浮液转移到需要的培养器皿（如多孔板）中，并直接对分化细胞进行研究。如果您的实验需要将肌管分离，并且难以用胰蛋白酶消化，您可以使用“橡皮刮刀”进行分离。

36.PromoCell是否提供特殊的3-D系统来阻断去分化，或者PromoCell是否具有稳定软骨细胞表型的特殊培养条件？

PromoCell提供的软骨细胞（HCH）可以使用软骨细胞生长培养基（C-27101）在正常的单层培养中扩增。该培养基采用了经过优化的配方，并添加了10%的胎牛血清（FCS）。软骨细胞的去分化是一种已知现象，在体外培养约2周后可观察到，但是需要体外培养先对细胞进行扩增。一旦获得了适当数量的细胞，单层系统可以转变为更复杂的三维系统，可以通过在凝胶或可降解聚合物支架等基质上培养细胞，或者使用三维球体培养来实现。在适当的条件下，重新分化被触发，细胞开始再次产生软骨特异性的细胞外基质。

PromoCell没有提供特殊的培养系统，但在质量控制过程中，PromoCell使用三维球体培养和Alcian Blue染色来表征培养的软骨细胞。该方案与用于MSC软骨发生分化的方案相似。

37.PromoCell的3D Tumorsphere Medium XF（C-28070）是否能够维持癌症干细胞的干细胞特性？

在PromoCell的质量控制过程中，不确定肿瘤球中相应干细胞标记物的存在或维持情况。相反，使用了一种功能性的方法，通过在C-28070中连续传代培养肿瘤球。肿瘤球的形成需要抗失重死亡（Anoikis）抵抗和自我更新的生物特征，由此表明肿瘤球中存在癌症干细胞（CSC）/癌症发起细胞（CIC）。因此，三维肿瘤球培养使科学家能够研究CSC的生物学特性，而无需对CSC标记物。

38.PromoCell是否有关于M1/M2型巨噬细胞激活后细胞因子谱和不同标志物的数据?

不提供M1/M2巨噬细胞在激活后的细胞因子谱和不同标记物的数据，并且在质量控制范围之外不提供任何其他数据。

39.用于造血祖细胞扩增培养基XF（C-39891;5ml）的Cytokine Mix E (C-39891)可以无菌分装储存吗？

可以将 5 ml Cytokine Mix E （C-39891）按5 x 1 ml进行均等分。

40.能否控制类器官的大小或分布大小?

器官样体的大小可能取决于凝胶中营养物质的供应。建议参考文献 https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/31173716/。

为了获得最佳结果，PromoCell建议采取以下措施：避免营养梯度。建议使用小的、类似水滴的BME凝胶珠和大量培养基。每天更换培养基，因为我们观察到较低的培养基更换频率会导致培养基变黄，表明可能由于细胞代谢增加导致pH改变。

为了获得最佳的细胞分布，控制ECM凝胶的固化非常重要。因此，温度是关键！BME在低温（4°C）下是液体，在37°C下固化。凝胶必须在很短的时间内完成，否则BME中的细胞会沉到底部。

41.什么是EXCiPACT™ GMP认证？

EXCiPACT™ GMP认证是指根据良好生产规范（GMP）的原则进行制药辅料生产。为此，包括EFCG、IPEC和PQG在内的一群行业专家共同合作，制定了适用于制药辅料供应商的EXCiPACT™认证计划。EXCiPACT™是一个非盈利组织，负责监督和运营一个独立的、高质量的、第三方认证系统。该认证系统适用于全球的制药制造商和分销商。为了获得EXCiPACT™ GMP认证，必须证明PromoCell的制药辅料是按照GMP指南制造的，并确保原材料供应链、生产环境、生产过程和储存条件符合要求。

42.如何预防上皮细胞制品中的成纤维细胞污染？

在原代细胞培养中，无法完全避免成纤维细胞的污染。由于上皮细胞比成纤维细胞更牢固地附着，可以通过部分Trypsin处理来去除成纤维细胞。具体操作是将Trypsin/EDTA加入细胞培养器皿中，保持2-4 min。当成纤维细胞脱离后，终止消化，将含有成纤维细胞的悬浮液吸走。剩下的上皮细胞用缓冲液洗涤两次，然后在相应的生长培养基中继续培养。

43.是否可以在96孔板或384孔板中进行巨噬细胞分化?

通常在T75培养瓶和6孔板中进行巨噬细胞分化。在96孔板或384孔板附着阶段，后期彻底清洗孔表面以去除非附着细胞过程中可能会造成成熟巨噬细胞的脱离，重新附着后最终可能会导致显著的细胞损失（30-50%）。并且在96/384孔板中会发生培养基蒸发和干孔等问题。

44.PromoCell是否推荐特定的培养原代细胞的组织培养器皿制造商或品，或者可以使用市场上的任何供应商?

PromoCell的客户已成功地使用了来自所有领先细胞培养器皿供应商的细胞培养瓶和培养皿来培养PromoCell的原代人类细胞。由于不确定来自当地细胞培养器皿供应商的培养器皿是否能够以同样的方式工作，建议首先测试这些品牌是否提供与领先制造商的培养器皿相同的良好性能。

45.将人类间充质干细胞分化为成熟的脂肪细胞后，需要使用什么培养基来培养这些细胞？

将hMSC分化为成熟的脂肪细胞大约需要2周的时间。可以在MSC脂肪分化培养基中保持脂肪细胞长达3周。在3周后，建议切换到PromoCell的脂肪细胞营养培养基（C-27438）。

46.黑素细胞生长培养基M2补充物混合物（C-39420）的组成是什么？

黑素细胞生长培养基M2补充物混合物（C-39420）不含血清，也不含任何PMA。其定性和定量组成是专有的。

47.PromoCell的正常人毛囊真皮乳头细胞（HFDPC）来自哪里？

PromoCell的正常人毛囊真皮乳头细胞（HFDPC）的来源是从正常人头皮毛囊的毛乳头中分离得到的。成年毛囊中的毛乳头在控制毛发生产的皮-表皮相互作用和毛发生长周期事件中起着重要作用。毛囊真皮细胞在第二代时被冷冻保存，并且在使用PromoCell毛囊真皮乳头细胞生长培养基（Cat. C-26501）时，可以培养至少10倍的数量倍增。典型的数量倍增时间为20-36 h。解冻或胰蛋白消化后的推荐种植密度为5,000-10,000 cells/cm²。使用1:4的分裂比例，可以进行4-5代的细胞培养。

48.PromoCell微血管内皮细胞（HDMEC）对血管生成刺激是否能够做出迁移和管生成反应？

原则上，所有微血管内皮细胞都应该能够在适当的实验条件下对血管生成刺激作出迁移、增殖和形成管道或出芽的反应。由于这不是PromoCell例行的质量控制程序的一部分，无法确定所有细胞批次是否会对血管生成刺激作出反应。然而，PromoCell还提供经过预筛选的HDMEC（C-12215），专对VEGF产生阳性反应。

49.如何储存PromoCell的培养基及补充物？

在收到时，基础培养基应在4°C至8°C之间储存，补充物应在-20°C储存。

50.周细胞可以分化为什么种类的细胞？

已经证实，周细胞可以分化为脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞、纤维母细胞/肌纤维母细胞、血管平滑肌细胞和吞噬细胞等。

51.PromoCell的HUVEC可以传多少代？

PromoCell的HUVEC可以进行至少15次细胞数量倍增。可以进行的传代次数取决于细胞传代时使用的稀释倍数。如果将细胞按1:4传代，每个传代可以进行约2倍，这意味着可以进行至少6-8个传代的培养。

52.是否可以在37°C下用胰蛋白酶处理PromoCell正常人细胞？

PromoCell建议在室温下使用胰蛋白酶处理所有正常人细胞，并在显微镜下观察细胞的脱落情况。在37°C下长时间使用胰蛋白酶可能会对细胞造成不可逆的损伤。

53.在PromoCell造血祖细胞扩增培养基XF中扩增的hCD34祖细胞，是否可以将hCD34祖细胞重新冷冻？

是的，可以对它们进行重新冷冻。

54.是否可以在 96 孔板中将PBMC分化为M1巨噬细胞？

PromoCell尚未在96孔板中测试过从外周血单个核细胞（PBMC）分化出M1巨噬细胞，但我们了解到用户已经成功实现了这一点。根据客户的反馈，PBMC在96孔板中可以很好地分化。每个孔的适宜细胞密度为100万个PBMC（未经单核细胞含量确定）。在96孔板中的工作体积通常为100µl。

55.不小心将Cryo-SFM储存在-20°C。这种情况下，产品还能使用吗？

根据产品手册，Cryo-SFM应该在4-8°C下存储。然而，由于该溶液用于在液氮中冷冻细胞，PromoCell认为将Cryo-SFM存储在-20°C一次不会对产品质量产生负面影响。解冻后，请按照建议将其存储在4-8°C。

56.PromoCell M1巨噬细胞在解冻后是否可以在含有10%FBS和GM-CSF的MEM α培养基中培养？

PromoCell从未在含有10%FBS和GM-CSF的MEM α培养基中测试过PromoCell M1巨噬细胞的培养，无法预测其效果，因此强烈建议使用PromoCell的M1巨噬细胞生成培养基XF和涂有纤维连接蛋白的培养器皿。

57.在分化完成后（第7/8天），单核细胞衍生的树突状细胞在培养中可以维持多久？

根据PromoCell的经验，在分化完成后（第7/8天），单核细胞衍生的树突状细胞可以在培养中维持3至7天。然而，它们的形态会发生变化，并且看起来越来越差。

58.能够分化为神经细胞系的间充质干细胞（MSC）的比例有多大？

通常情况下，使用PromoCell的间充质干细胞神经分化培养基（C-28015）进行分化后，90-100%的人类间充质干细胞（hMSC）会呈现出神经形态。其中60-80%的细胞在尼氏染色后呈阳性反应，显示出尼氏小体。然而，分化能力取决于细胞的来源和经历的倍增次数。

59.在培养PromoCell的间充质干细胞时，可以期待的细胞倍增时间是多久？从播种到传代培养需要多长时间？

在培养PromoCell的间充质干细胞（hMSC-BM、hMSC-AT、hMSC-UC）时，使用间充质干细胞生长培养基2（C-28009）您可以预期的倍增时间通常≤ 30 h。如果以4,000 cells/cm²的密度进行接种，需要4-7天才能达到传代密度。

60.内脏脂肪和皮下脂肪之间有什么区别？应该在什么情况下使用哪种细胞类型？

PromoCell的前体脂肪细胞是从皮下脂肪或内脏脂肪中分离得到的。皮下脂肪位于皮肤下方，与肥胖相关的疾病无关。它的积累代表了过量能量摄入的正常生理反应。当皮下脂肪的储脂能力过盛或新的脂肪细胞生成受损时，内脏脂肪开始积累，它位于腹部和内脏器官周围（如肾脏、心脏或膀胱），与高血压、糖尿病和心血管疾病有关。来自皮下脂肪和内脏脂肪的脂肪细胞在多个功能上存在差异，如对胰岛素和其他激素的反应或脂解活性。哪种细胞类型最适合您的实验，很大程度上取决于所研究的科学问题。

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