【PromoCell】PromoCell细胞相关问题及解答（四）

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PromoCell Trypsin 成骨细胞 C-12660 C-41200 C-41202 HNEpC SkMC C-22010

92.细胞传代时，可以使用生长培养基代替TNS终止胰蛋白酶的消化作用吗？

为了完全灭活胰酶，需要> 10% FBS的浓度。由于PromoCell的大多数生长培养基都是血清减少或无血清的，强烈建议使用胰酶抑制剂TNS。因此，不能用生长培养基替代TNS来停止胰酶消化。

93.可以使用Accutase代替Trypsin来消化细胞吗？

可以使用Accutase来分离正常人细胞。Accutase对细胞的作用非常温和，不会对细胞膜和表面表位造成损害。因此，它主要用于需要保持表面标记不变的应用，例如流式细胞术，或者用于分离非常敏感的细胞。

94.是否可以将PromoCell成骨细胞进行矿化？

可以将PromoCell成骨细胞进行矿化。简短的实验步骤：将人骨母细胞接种在涂有胶原I的培养皿上，使用骨母细胞矿化培养基培养细胞。孵育细胞17-21天，每隔三天更换培养基。注意不要干扰细胞单层的形成。固定细胞后，可以通过von Kossa或Alizarin Red染色来可视化钙沉积。有关骨母细胞矿化和Alizarin Red S染色的更详细信息，请参考附带的应用说明，扫描下方二维码，获取说明（Osteoblast_Differentiation_and_Mineralization-1.pdf (promocell.com)）。

95.同一批次或同一捐赠者那里，PromoCell通常能提供多少瓶MNC-PB？

每个捐赠者和每次捐赠的血液样本中可以生产的MNC-PB小瓶数量存在很大的差异。这是由于捐赠者之间的个体差异，有些捐赠者每毫升血液中的MNC数量更多，而其他捐赠者则更少。一般来说，每个批次的小瓶数量（每个小瓶中含有25 x 10⁶个冷冻保存的细胞）在10到40之间。

96.是否可以将SupplementMix进行分装？

可以在收到SupplementMix后分装成小瓶，并将2个或4个独立的小瓶冷冻在-20°C。这样可以制备更小体积（2 x 250 ml或4 x 125 ml）的完整培养基，从而延长培养基的使用时间。

97.血清浑浊的原因是什么？

血清的浑浊通常是由于在冷冻和解冻过程中脂质成分的结晶所致。血清经过多次冻结/解冻循环，浑浊度会越明显。可以通过将血清分装成小瓶，在-20°C下冷冻，并在使用时逐个解冻小瓶，以最小化浑浊度。

98.为什么 PromoCell 只保证15次数量倍增培养，而自己分离的真皮成纤维细胞通常可以达到30次传代？

PromoCell的质量控制程序包括对成纤维细胞进行15次数量倍增培养。这是为了确保细胞至少可以培养15次PD（根据使用的分裂比例，相当于6-8个传代），但并不意味着细胞在达到这个点后立即衰老。并没有确定最大倍增次数或传代次数，但大多数NHDF批次肯定可以达到超过20次传代。

99.PromoCell 角质形成细胞需要供养细胞（feeder cells）吗？

如果您在使用PromoCell的角质形成细胞生长培养基2（C-20011）或生长培养基3（C-20021）中培养NHEK细胞，那么不需要任何供养细胞。细胞将在传统的组织培养瓶中以单层形式生长。

100.NHEK.f和NHEK.f pooled有什么区别？

NHEK.f是从单个供体（1-10岁之间）的组织样本（包皮）中分离得到的。NHEK.f pooled是由3个独立供体的包皮制备而成。每个供体的细胞在单独的组织培养瓶中扩增，然后在二次培养后将细胞混合，再进行冷冻保存。解冻后，NHEK.f和NHEK.f pooled都处于P2阶段。

101.PromoCell (C-14**) 的细胞沉淀在 -20°C 下不冻结属于正常现象吗？

在RNAlater中的样品在-20°C下不会冻结，它们在4°C和-20°C下都是液体状态。这些样品可以在4°C下储存长达1个月，并且在室温下稳定保存一周。在-20°C下，它们可以无限期地储存。

102.使用单核细胞附着培养基 (C-28051) 通过贴壁来分选富集单核细胞有哪些优势？

使用Monocyte Attachment Media (C-28051)进行贴壁来分选富集单核细胞的方法具有以下优势：

1)快速：该方法仅需1.5 h即可产生大量的粘附单核细胞。

2)高纯度：如果正确执行洗涤步骤，可以达到80-90%的纯度。

3)无干扰：贴壁的细胞因为没有与磁性微珠的结合，排除了单核细胞对微珠的吞噬发生，因此细胞是无干扰的。

4)时间和成本效益：贴壁法是节省时间和成本的方法。

103.可用于荧光、发光和比色检测的多孔板有哪些不同类型？

可以在荧光、发光和比色检测中使用的不同类型的多孔板有以下几种：

1）荧光检测（荧光仪）：黑色底部透明的板；通常透明的板就足够，这有助于减少背景荧光干扰。

2）发光检测（发光仪）：白色或不透明的板。这有助于增强发光信号并减少背景干扰。

3）比色检测（光度计）：透明的板。这有助于准确测量吸光度。根据具体的实验需求和仪器要求，可以选择适合的多孔板类型。

104.Promocell HREpC (C-12665)与HRCEpC (C-12660)有什么区别？

Promocell的HREpC (C-12665)是从肾皮质和髓质中分离出的肾上皮细胞的异质混合物。而HRCEpC (C-12660)仅来源于肾皮质。

105.应该使用 PromoCell DetachKits C-41200 或 C-41202 中的哪一个来对 HNEpC 进行胰蛋白酶消化？

可以使用PromoCell标准DetachKit (C-41200) 来传代人类鼻上皮细胞。一些客户仍然喜欢使用PromoCell DetachKit-2 (C-41202)，因为它的Trypsin/EDTA浓度较低，但是在细胞培养实验室的测试结果显示，使用C-41200并没有发现任何不良影响。

106.PromoCell骨骼肌细胞（SkMC）从哪些组织分离得到？

PromoCell骨骼肌细胞主要是从胸肌（M. pectoralis）中分离出来，有时也从腓肠肌（M. gastrocnemius）、肋间肌（M. intercostales）或臀大肌（M. gluteus maximus）中分离出来。具体的分离位置在分析证书中有说明。

107.PromoCell人类血细胞在到达时处于第几代？

PromoCell的血细胞和血祖细胞在分离后直接冷冻保存（= P0）。在冷冻之前，没有进行培养。

108.使用PromoCell的内皮细胞生长培养基（C-22010）来培养自己的HUVEC细胞。是否需要补充培养基中的额外因子，比如胎牛血清（FCS）？

PromoCell的内皮细胞生长培养基（C-22010）是一种完全培养基，在添加SupplementMix后可用于HUVEC的培养。不需要额外添加FCS。SupplementMix中含有FCS（最终浓度为2% v/v），重组生长因子、激素和牛脑提取物，这些成分共同对内皮细胞具有促分裂作用。

109.冷冻正常人类细胞的最佳方法是什么？

简要步骤：按照通常的方法将细胞解离；离心并以适当的冷冻培养基将细胞密度调整为1~4 X 10⁶ cells/ml；将细胞置于梯度冻存盒中并放入-80°C。推荐使用Nalge的“Mr. Frosty”或Biocision的“CoolCell”，它们在放入-80°C冷冻箱过夜时提供逐渐和可控的冷却速率；将小瓶转移到液氮中进行长期储存。

110.为什么冷冻保存的巨噬细胞被缩写为hMDM-GMCSF(-)和hMDM-MCSF(-)？(-)代表什么含义？

hMDM-GMCSF是人单核细胞衍生的巨噬细胞的缩写。它们是偏极化[⇒通过GM-CSF分化]但非激活的[⇒(-)] M1型巨噬细胞。hMDM-MCSF是人单核细胞衍生的偏极化[⇒通过M-CSF分化]但非激活的[⇒(-)] M2型巨噬细胞。这些巨噬细胞可以接种到各种细胞培养器皿中。接种后，它们可以作为具有生物功能的贴壁培养物维持数周。可以选择性地对细胞进行用户可定制的激活（图3所示方法）。

图 3 M1和M2的极化

111.根据PromoCell的分化方案从自体来源的PBMC中分化出M1型巨噬细胞。在最后的细胞培养中，可以看到贴附在巨噬细胞上的小细胞，即CD3 + ( T细胞)。分化后T细胞污染的原因是什么?

在巨噬细胞分化过程中，从自身提取的外周血单个核细胞（PBMCs），在最终的细胞培养物中，可以看到附着在巨噬细胞上的小细胞，它们是CD3+（T细胞）。巨噬细胞培养物中淋巴细胞数量较高的原因可能是在通过贴壁法纯化单个核细胞的过程中洗涤步骤不足。PromoCell方案中的3次洗涤步骤对于获得90%以上的单个核细胞群体是必不可少的。

112.能否用肉眼观察支原体污染情况?

只能通过电子显微镜观察到支原体。为了高度敏感地检测支原体污染，推荐使用基于PCR的支原体检测方法。

113.应向PromoCell基础培养基中加入多少浓度的抗生素？

如果认为需要添加抗生素，推荐的最终浓度为：100 U/ml青霉素 + 100 µg/ml 链霉素或50 µg/ml 庆大霉素 + 50 ng/ml两性霉素B。注意：添加抗生素可能会降低细胞的生长速率。

114.在Hematopoietic Progenitor Cell Expansion Medium XF (C-28021)中，CD34+祖细胞会以何种程度增殖？

为了获得最佳的细胞生长，人源CD34+祖细胞 (C-12921) 在 PromoCell Hematopoietic Progenitor Cell Expansion Medium XF (C-28021) 中培养，并添加 Cytokine Mix E (C-39890) 或其他适合实现最佳细胞扩增的细胞因子混合物。Cytokine Mix E 包含重组人 TPO、SCF、flt3-ligand 和 IL-3。CD34+细胞的强烈扩增将持续约2周。扩增因子通常在75至200倍之间。

115.选择或排除外周血献血者的标准是什么？

血液捐赠的选择和排除标准如下：

a) 轻微感染，如感冒或咳嗽，被排除一周；

b) 感染并伴有体温超过37.9°C和/或使用抗生素治疗的捐赠者被排除四周；

c) 血压：只有当收缩压低于100 mm Hg或高于180 mm Hg，或舒张压高于100 mm Hg时才会被排除。如果血压接受药物治疗并保持在可接受范围内，则不被排除；

d) 高胆固醇：即使使用药物，也不会被排除；

e) 糖尿病：如果是1型糖尿病或使用胰岛素，将被排除；

f) 类固醇使用：使用类固醇后四周内将被排除；

g) 癌症：被排除；

h) 其他慢性疾病：是否排除取决于疾病的类型（例如慢性心脏病、自身免疫性疾病）。

PromoCell用于分离血细胞（MNC-PB，单核细胞）的外周血来自完全健康的捐赠者。

116.要培养或分化PromoCell的人源干细胞和血细胞，应使用哪种培养基？

特定细胞类型的推荐培养基在对应产品页面的“推荐产品”部分中有详细说明，并可在该细胞所属的手册中找到。

117.PromoCell的HPMEC（C-12281）分离自什么组织？

PromoCell的HPMEC（C-12281）是从成年捐赠者的外周肺组织中分离得到的。

118.在融化补充剂时观察到有絮状物，是否正常？

在解冻含有ECGS/肝素或BPE的补充剂时，可能会看到轻微的絮凝物。这不会影响培养基的活性。可以选择在无菌条件下通过离心将沉淀物去除。建议在15-25°C下解冻补充剂（SupplementMix或SupplementPack）。

119.是否可以反复冻融Cytokine Mix M1 (C-39894) and M2 (C-39895)？

Cytokine Mix M1和M2不应反复冻。

120.在使用巨噬细胞脱离溶液（Macrophage Detachment Solution）将巨噬细胞分离后，为什么要在PBS洗涤液中添加人血清白蛋白（HSA）？

巨噬细胞脱离溶液（Macrophage Detachment Solution）直接影响细胞膜。洗涤缓冲液中的HSA支持细胞膜的再生，并在分离后的关键阶段保护细胞免受有害影响。

121.使用PromoCell Mesenchymal Stem Cell Osteogenic Differentiation Medium对hMSC-BM进行诱导分化的预取分化率是多少？

PromoCell Mesenchymal Stem Cell Osteogenic Differentiation Medium对hMSC-BM进行诱导分化时，预期的分化率为70-100%。

122.内皮细胞生长培养基或成脂前细胞生长培养基中的ECGS浓度是多少？

ECGS在制造过程中的蛋白质含量被调整为3 mg/ml。对于人类内皮细胞和微血管内皮细胞，ECGS的最佳浓度是每500 ml培养基中添加2 ml，相当于每500 ml培养基中提取的蛋白质为6 mg。ECGS/H还额外补充了22.5 mg/ml肝素，相当于每500 ml培养基中的最终肝素浓度为45 mg。

123.HPMEC获取自肺的哪个组织？细胞来自小动脉还是毛细血管？

HPMEC（人类肺微血管内皮细胞）（C-12281）是从肺实质中获取的，之前已经去除了所有大血管。因此，大部分的HPMEC来自毛细血管。

124.PromoCell HCMEC是否代表心内膜细胞，即心室内壁细胞？

PromoCell的HCMEC（人类心脏微血管内皮细胞）不代表内膜细胞，即心室内壁的细胞。它们是从心肌的毛细血管中分离出来的。因此，它们实际上是微血管内皮细胞。

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