【PromoCell】PromoCell细胞相关问题及解答（三）
61.人体皮肤淋巴内皮细胞（HDLEC）的确切定位于哪里？应该使用什么培养基来培养它们？
PromoCell的HDLEC是从皮肤（真皮）中分离得到的。当从幼年供体（C-12216）中分离时，确切的定位是包皮。当从成年供体（C-12217）中分离时，定位取决于手术类型，例如乳房或太阳穴。您可以在分析证书中找到关于确切定位的信息。PromoCell的HDLEC经过CD31、podoplanin和Prox-1的阳性测试，并以P2状态提供。推荐使用的培养基是内皮细胞生长培养基MV2（C-22022）。
62.我应该如何使用Accutase对细胞进行分离？
使用Accutase进行细胞分离的方法如下：
简要步骤：
1)用无菌PBS或HepesBSS洗涤细胞。
2)将未稀释的Accutase加入培养容器中（每25 cm2加入2 ml）。
3)在室温下孵育5-15 min，或者置于37°C下以加快细胞脱离速度。
4)当大部分细胞分离时，离心悬浮液，并将沉淀重新悬浮于新的培养基中。大多数情况下，不需要额外的洗涤或中和步骤。
63.在什么情况下应该订购生长培养基套装而不是“即用型”培养基？
生长培养基套装可以自定义生长补充剂的最终浓度。因此，它比“即用型”培养基更灵活，可以用于制备低血清培养基等。请注意：修改补充剂浓度可能会影响细胞的生长。您应提前测试细胞是否能够在改变的培养条件下存活以及存的活时间。
64.MSC群体的同质性如何？当用MSC成骨分化培养基（C-28013）培养时，是否所有MSC都会变成成骨细胞？
人间充质干细胞（MSC）保留了分化为多种细胞类型的能力，包括脂肪细胞、软骨细胞和成骨细胞。PromoCell提供来自3种不同组织的hMSC，包括骨髓（hMSC-BM, C-12974）、脐带基质（hMSC-UC, C-12971）和脂肪组织（hMSC-AT；C-12977）。MSC-BM在使用相应的分化培养基时，显示出很好的骨细胞分化能力，但也可以分化为软骨细胞和脂肪细胞。MSC-UC具有很高的软骨细胞分化潜力，但对脂肪或骨细胞分化的潜力较弱。相比之下，MSC-AT在脂肪和骨细胞分化方面表现出很好的能力，但在软骨细胞分化方面只有中等水平。为了获得高比例的骨细胞，MSC-BM或MSC-AT是首选细胞。当然，不同批次之间会有差异，并且分化能力会随传代次数增加而逐渐降低。如果您需要具有特别高成骨细胞分化能力的MSC，您可以在下订单之前致电PromoCell的技术客户服务，以便为您选择适当的细胞批次。
65.PromoCell的正常人类细胞可以在标准培养基（如DMEM或RPMI1640）中添加10% FBS进行培养吗？
PromoCell的生长培养基具有特殊配方，比DMEM或RPMI + FBS复杂得多。与免疫化细胞系相比，原代细胞对营养物质和生长因子的需求更高。传统的培养基通常无法很好地支持PromoCell细胞的生长。
66.可以从PromoCell细胞沉淀中分离RNA和蛋白质吗？
可以从PromoCell细胞沉淀中分离出DNA、RNA和蛋白质。
67.PromoCell能够保证正常人类细胞的倍增数量是多少？
对于大多数正常人类细胞（除非在分析证书上另有说明），PromoCell保证使用推荐的PromoCell培养基和PromoCell分离试剂盒时，可以进行15次数量倍增（PD）。
68.当购买PromoCell增殖培养物（C-12760）时，瓶中有多少成骨细胞？
当您购买增殖培养物（C-12760）的时候，瓶内会有超过500,000个成骨细胞。一旦培养物达到次临界浓度，每个T25培养瓶中达到在750,000至1.1×106个细胞之间（取决于细胞批次）。
69.培养的正常人类细胞细胞形态发生改变，原因可能是什么?
培养基的改变、与其他细胞类型的交叉污染，或细胞分化或衰老均可引起细胞形态的改变。
图 2 细胞形态改变应对指南
70.一般来说，软骨细胞接种后，需要多长时间才能长至亚融合状态?每次传代会经历多少次倍增?
通常，PromoCell的正常人软骨细胞（Normal Human Chondrocytes，C-12710）需要5到8天的时间才能生长融合状态。它们传代的倍增数（PDs）可以通过播种细胞数和融合状态下的细胞产量来计算。一般来说，当以每平方厘米10,000个细胞的密度播种软骨细胞时，它们每次传代会进行1.5到2次倍增。
71.在培养鼻上皮细胞时是否需要用涂层培养瓶？
鼻上皮细胞不需要在涂层培养瓶上培养。因此，我们在说明书中不推荐使用涂层培养瓶。然而，对于特殊应用，一些客户使用胶原涂层培养皿。
72.可以将SkMC补充剂与骨骼肌细胞基础培养基混合并分装冷冻储存以备后用吗？
PromoCell的基础培养基必须在4-8°C之间储存，不得冻结，因为冻存可能导致沉淀物的产生。添加了补充剂后的完全培养基也必须保持在4-8°C。如果您希望制备较小体积的完全培养基，可以将补充剂混合液分装成小份，并在-20°C下重新冷冻，直到使用，再进行完全培养基的配制。
73.从PromoCell购买的软骨细胞，是否可确保它们是关节软骨细胞，即来自膝关节？
PromoCell所有的软骨细胞（C-12710）都是从膝关节或股骨头中分离得到的。如果需要特定位置的软骨细胞，请在下订单之前联系我们的技术客户服务部门。他们将向您提供所需位置的可用批次号码。
74.PromoCell推荐那种培养基用于内皮细胞的转染？
有几个因素可能会影响转染的成功率，例如细胞的存活率和密度，转染试剂的选择，转染分子（质粒、siRNA、寡核苷酸）的质量和类型，以及使用的培养基和补充物。
当使用PromoCell内皮细胞生长培养基进行细胞转染时，请按照以下说明操作：内皮细胞生长培养基（C-22010/C-22110）、Medium 2（C-22011/C-22111）和Medium MV（C-22020/C-22120）中含有肝素，可能会降低转染效率。因此，推荐使用不含肝素的内皮细胞生长培养基MV2（C-22022/C-22121）。或者，可以使用内皮细胞生长培养基套装（C-22110）、Medium 2套装（C-22111）或Medium MV套装（C-22120），在基础培养基中不添加ECGS/肝素补充物。请注意：转染前后，细胞应在包含肝素的完整生长培养基中培养，以确保最佳生长效果。
75.按照 M1 巨噬细胞的推荐接种密度（100,000 cells/ cm2），需要太多细胞量才能获得完整的 96 或 384 孔板的培养。为了降低成本是否可以降低细胞密度？
按照推荐的密度，每平方厘米播种100,000个M1巨噬细胞，这样可以获得一个密集的细胞层，因为这些细胞不会增殖。然而，将播种密度降低3到5倍，巨噬细胞仍然可以存活。这样做可以减少您所需的细胞数量，从而降低成本。
76.为什么PromoCell的产品仅供体外研究使用？
PromoCell产品被标注为“仅供体外研究使用”的原因是基于销售条款和条件中对产品使用的定义。
77.如何建立类器官高通量系统？
可在96孔U型底板（如Greiner Bio-One #650185）中培养气道类器官。关于使用96孔板的详细方案，请参考所提供的应用笔记，扫描下方二维码，获取内容（App-Note-Airway-Organoid.pdf (promocell.com)）。尚未测试过384孔板或其他商业可用的板子。
78.在哪里可以获得PromoCell物质安全数据表和支持文件？
可以使用产品批号在以下网址下载支持文件：www.promocell.com/eq-certificates（扫描下方二维码，进入网址），物质安全数据表（MSDS）可以直接从PromoCell网站上的产品页面下载。
79.使用PromoCell的巨噬细胞生成培养基来培养外周血单核细胞（PBMC）来获得分化的巨噬细胞，通过在单核细胞附着培养基（也来自PromoCell）中培养PBMC 1.5 h来分离单核细胞。如果附着步骤过夜来完成，是否可以？
不建议将血细胞在单核细胞附着培养基中放置超过1.5-2 h。该培养基是为了（短期）附着单核细胞而开发的，并不能提供长时间的养分。将细胞在单核细胞附着培养基中放置更长时间甚至过夜会诱导细胞凋亡并导致细胞的损失。如果有需要，可以将孵育时间缩短到1 h。在这种情况下，建议您预先在孵育箱中平衡培养基，这样可以立即添加适量的外周血单个核细胞悬浮液。
80.PromoCell是否推荐了一种用于从外周血单核细胞诱导生成树突状细胞的专用培养耗材?
通常情况下，PromoCell不推荐使用特定的培养耗材，但发现在使用PromoCell的树突状细胞和巨噬细胞培养基时，培养耗材的选择可能会有很大的影响。对于的PromoCell树突状细胞培养基，建议使用BD FalconTM的组织培养器皿。
81.DC Base Medium XF (C-28054和DC Generation Medium XF (C-28052)有什么区别？
DC Base Medium XF (C-28054)是由250毫升基础培养基和补充物混合物组成的。它不包含细胞因子，因此必须根据用户的需求进行补充。DC Generation Medium XF (C-28052)是一种即用型培养基，由250毫升基础培养基、补充物混合物和适当的细胞因子组成。但这两种的配方是一致的。
82.PromoCell的HUVECs和ATCC的HUV-EC-C有什么区别？
PromoCell的HUVECs是从脐带静脉中新鲜分离得到的。它们在初级培养结束时被冷冻保存。经复苏后，可以进行至少15次传代，最终会衰老。ATCC的HUV-EC-C是一种来自人类内皮细胞（脐带静脉）的次二倍体细胞系。在72%的计数细胞中出现细胞的染色体数目为45。多倍体细胞的比例为15.8%。这些细胞的寿命为50至60细胞倍增次数。这表明这些细胞已经不再是“正常细胞”，而是经历了一定程度的转化。
83.在Hematopoietic Progenitor Cell Expansion Medium XF (C-28021)中，如果没有添加Cytokine Mix E (C-39890)，造血祖细胞（CD133+细胞、CD34+细胞）是否会增殖？
对于造血祖细胞（CD133+细胞、CD34+细胞）的扩增，PromoCell开发了Hematopoietic Progenitor Cell Expansion Medium XF (C-28021)，这是一种无血清和无异质配方的培养基，该培养基必须添加Cytokine Mix E (C-39890)或用户自己的细胞因子混合物。Cytokine Mix E是一种即用型混合物，含有重组人TPO、SCF、flt3-ligand和IL-3。在Expansion Medium XF + Cytokine Mix E中，造血祖细胞的强烈扩增可以持续至少两周，使细胞数量增加200-300倍，仅有20-30%的细胞分化。注意：如果起始细胞为CD133+细胞，在这个扩增步骤中，CD133标记会丢失。最终得到的细胞为D34+/CD38–/CD133–。
84.PromoCell DetachKit的组分有时会呈现不均匀的颜色，是否影响质量？
PromoCell DetachKit的组分有时可能会呈现不均匀的颜色，这种现象是可逆的，并不影响产品的质量。
85.进行MSC成软骨、成脂和成骨分化，并对细胞进行染色的实验中，操作指南规定使用Saccomanno固定液，是否有另一种方法来固定细胞?
是的，可以使用4.5%的中性缓冲甲醛固定液。也可以使用多聚甲醛。
86.为什么在Alizarin Red染色方案（“MSC的成骨分化及分析”）的最后一步加入PBS？分析前是否应吸除PBS？
在Alizarin Red染色方案的最后一步中加入PBS是为了增强Alizarin Red染色（染料的沉淀）。在染色或洗涤后保留PBS在细胞上，并立即分析样品，因为染料可能在未嵌入的情况下在长时间存储染色样品时渗出。
87.冻存在液氮中的原代细胞的使用日期是多久？
PromoCell细胞在液氮的气相中冷冻（计算机控制的冷冻机），然后存储在液氮的液相中。在液氮中的冷冻保存是一种被认可的长期保存原代细胞和干细胞的方法。在液氮中存储，细胞可以保持超过10年的时间而不会影响其存活率。例如，Kumar等人的研究表明，脂肪来源的干细胞在液氮中保存大约12年后仍保持其再生潜力、干细胞特性、存活率和分化能力。
88.PromoCell的人类子宫成纤维细胞（HUF）是从子宫肌层（myometrium），还是子宫位置因批次而异？
PromoCell所有的人类子宫成纤维细胞（HUF）都是从子宫肌层（myometrium）制备的。
89.PromoCell推荐何种DC培养基用于新鲜分离的MNC或单核细胞，何种培养基用于冻存的单核细胞？
PromoCell推荐使用DC Generation Media来方便和高效地从外周血单核细胞中生成未成熟和完全成熟的髓样树突状细胞。对于新鲜分离的单个核细胞（MNC）和单核细胞，推荐使用DC Generation Medium XF（C-28052），对于冷冻保存的单核细胞，推荐使用DC Generation Medium（C-28050）。当使用DC Generation Medium（C-28050）与新鲜的MNC时，需要在第一步中使用Monocyte Attachment Medium（C-28051）使单核细胞有效地附着。
90.HWP的增殖、分化和培养的关键点是什幺?
PromoCell的正常人类白色成脂细胞（HWP）是从不同部位的成年皮下或内脏脂肪组织中分离得到的。细胞在第一次传代（次级培养）结束时在Cryo-SFM中冷冻保存。然后随机选择一管细胞进行质量控制，包括确定生长特性、形态学控制以及分化为成熟脂肪细胞的能力的测试。解冻或胰酶消化后，建议将成脂细胞的种植密度设为5000 cells/cm2；细胞在达到90%的密度前应进行胰酶消化。数量倍增时间通常在20-40 h之间（保证能进行10次倍增）。使用1:4的分裂比，可以进行4-5次细胞传代。使用成脂细胞生长培养基（C-27417）来对细胞进行扩增培养。为了诱导成脂细胞向脂肪细胞分化，将细胞在PromoCell的成脂细胞生长培养基中培养，直到达到100%的密度。然后将细胞在成脂细胞分化培养基（C-27437）中培养72 h，接着在脂肪细胞营养培养基（C-27439）中培养10-14天。在此期间，细胞开始积累脂肪滴。建议在细胞数量的倍增次数低于4-5时进行分化实验，以达到培养物高分化水平的目标。
91.PromoCell是否确定HDLEC在其HDMEC批次中的百分比？
PromoCell不确定HDMEC批次中HDLEC和HDBEC的比例。根据经验，HDLEC的百分比高度依赖于批次，并且可以在5%和60%之间变化。
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