【Biolegend】TotalSeq™ Antibody Oligonucleotide Conjugates 常见问题
常见问题 FAQ
FAQ1: Cell hashing 有什么好处？
在 10X Genomics 及其它一些相当的单细胞测序平台上，若使用 Cell hashing 可以于一个泳道中运行多个样本，这增加了可同时分析的细胞或样本的数量，并降低了由批次或处理等造成的结果改变的风险；且当细胞数量较少时，还可以增大数据输出并获得更多的信息，充分利用单细胞测序平台。
FAQ2: 请问 Hashtags 到底是什么？
Hashtags 试剂用于样本标记，被标记的不同样本混合后经过一个泳道进行单细胞测序，再在数据分析时可对不同样本进行分析。不同于抗原特异性抗体，Hashtag 抗体需要尽可能覆盖更多的同种属细胞，对人或小鼠细胞具有种属特异性，因此对于来自人的样本，每种 Hashtag 抗体均由 CD298 和 β2 microglobulin 两种抗体组成，这两个表面标志物普遍表达于所有人来源的细胞，两种抗体均被标记上含有相同 Barcode 序列的 oligonucleotide，不同样本分别标记不同的 Hashtag 抗体，通过测序获得的 Hashtag 上的 barcode 序列识别样本的来源；同样的，对于小鼠样品，则标记的是在小鼠来源细胞上普遍表达的 CD45 和 H-2 MHCⅠ。所有的 Hashtag 抗体均为已和 oligonucleotide 偶联的即用型抗体。
FAQ3: FACS 抗体和 TotalSeq™抗体一起孵育染色会不会影响后续的实验？
厂家对此没有做过检测，但无竞争性的不同克隆号抗体是可以进行共染，因此靶向同一种抗原的不同克隆号抗体的共染应该适用于 FACS 及 CITE-seq 技术。在最先报道 CITE-Seq 技术的文章中（Stoeckius et al. (Fig. 2)），作者证明了共染之后的细胞可以用于后续的分析，虽然在这篇文章中并未使用 Total-seq 抗体，但是技术原理方案是一样的；此外，一些其它的 CITE-seq 用户也已经证明了这种共染的可行性。如果客户需要更多的信息，请联系 tech@biolegend.com。
FAQ4: 为什么去除死细胞在 CITE-SEQ 样本制备中那么重要？
若 CITE-seq 样本中存在死细胞，死细胞也会被计入单细胞测序的样本细胞范畴，这可能导致结果数据欠佳或捕获的阳性细胞数不够，尤其是当目标细胞群体比例非常低的时候。死细胞是可以通过磁珠分选去除的。但是如果需要先做 CITE-seq，再进行死细胞的排除，则可以使用更复杂的生物信息学方法过滤掉低质量的数据（可能包括死细胞）。建议使用此类方案时参考以下信息：
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4758103/
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28045081
FAQ5: 如何做 TotalSeq™抗体滴定实验？
厂家也正在对 TotalSeq™试剂的最佳使用浓度进行测定优化，另外对于抗体的滴定有以下建议可供参考：使用现成的 CITE-seq 方法进行滴定费用昂贵；但是使用 Hashtags 滴定之后确是可以降低相应的费用，其相关的滴定方案可参考 Stoeckius M ect. (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/30567574)。
CITE-seq 抗体的滴定方案一 —— 使用与 PE 偶联的相同克隆号抗体进行染色并使用流式细胞术进行滴定，流式细胞术滴定的最佳抗体量可以转化成 CITE-seq 抗体使用量。方案二 —— 用不同浓度的 TotalSeq™抗体标记细胞，偶联 poly-dT 寡核苷酸的荧光基团 (例如 AlexaFluor®647) 作为第二试剂来检测 TotalSeq™抗体。与方案一相比，方案二需要使用 TotalSeq™抗体，更加直接。
FAQ6: 哪些工具可以用于数据分析？
Cell Ranger 可以用于 Barcode 运算分析，但其中的一些应用可能不被 10X Genomics 支持；其他一些有用的数据分析的资源则包括 CITE-Seq-Count (https://github.com/Hoohm/CITE-seq-Count) 和 Satija Lab (https://satijalab.org/seurat/)。数据分析部分更多信息，请联系 tech@biolegend.com
FAQ7: 如果需要自行购买合成引物，可以在哪里合成，其对于纯度的要求是什么？
引物的合成的服务很多公司都能提供，我们建议使用 IDT。对于一些附属的引物，脱盐纯化即可；若是延伸引物，则需要经过 HPLC 或 PAGE 纯化。
FAQ8: 为什么除了 mRNA 文库外还需要构建 ADT/Hashtags 文库？
分别建库是为了使测序更加灵活。客户可根据需要的 Reads 数，在测序前调整两个文库的比例。
FAQ9: 在进行 CITE-Seq 前是否需要将细胞进行分选富集？决定是否需要进行富集分选的因素有哪些？
如果感兴趣的目的细胞群体未经分选富集即可进行聚类 / 识别，分选的必要性就没有那么大；但是若目的细胞群体所比例较少，若与对照或其他细胞群体相比可能因数据不够无法得出有效的结论，而这些数据恰恰是针对感兴趣的稀有细胞群体的，那么在这种情况下，若能在 CITE-seq 分析之前富集该目的细胞群体，将有助于获得更有意义的单细胞测序结果。当然，如果样品中的活细胞率低于 95%，我们还建议对死细胞进行去除即活细胞进行富集。
FAQ10: 寡核苷酸标签如何偶联到抗体上却不干扰抗体与靶蛋白的结合？
寡核苷酸连接抗体的方法和我们偶联荧光素到抗体上的方法是一样的，而这种偶联方案也经过了流式细胞术质量验证的。针对已经偶联了寡核苷酸的抗体，我们也会使用流式验证该抗体能否识别目的抗原，这也属于 TotalSeq™耦合物质检流程的一部分。
FAQ11: 是否可以同时进行 CyTOF® 和 TotalSeq™(CITE-seq)?
在同一个实验中不可以，因为 CyTOF® 需要相应的仪器和流程，且样品会在实验过程中被破坏。可以将一份样本分成两份分别进行 CyTOF® 和 CITE-seq 分析。而其实，CITE-seq 与 CyTOF® 两种技术方法获得的是相同的表面蛋白的信息，CITE-seq 在单细胞水平具备更多的 Panel 多样的可能性。
FAQ12: CITE-seq 这个技术可以延伸到 micro-RNA 吗？
这个应用在技术上具有很大的挑战性，因为 micro-RNA 非常小，其大小普遍等于或小于在过程中所需引物的大小，因此目前这种应用不太可能。
FAQ13: 在 CITE 技术中，自发荧光是否和流式细胞术一样需要考虑？
不需要，CITE-Seq 最后是通过输出的序列信息读取数据，这个不受细胞自发荧光的影响。
FAQ14: 通过 TotalSeq™标记检测蛋白质表达的灵敏度怎么样？
这主要与抗体亲和力，滴定度和抗原表达水平有关。BioLegend 公司和一些合作的科研人员正在做相应的滴定工作 (已发布数据:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/30567574)。从理论上讲，只要有一个抗原分子被抗体结合，PCR 扩增和测序就可以将这份信息识别。针对这当中可能存在的背景噪音，常用的质量控制方法是在过程中添加阴性细胞，例如，如果样本是人的 PBMC，则使用小鼠的细胞作为阴性参照，反之亦然。
FAQ15: 每次实验需要多少个细胞？
这取决于需要回答的生物学问题。从技术角度而言，10X Genomics Chromium 单细胞分析平台建议每个泳道上样 5,000-10,000 个细胞，若使用 Hashtag，则可以增加样本细胞上样数。为了便于染色，我们通常建议使用 100 万个细胞，但是实际数目还取决于细胞的可用性以及实验员处理低数量的细胞的能力。
FAQ16: 一个样本可以同时共染多少个 TotalSeq™抗体？
Peterson VM 等人在 “Multiplexed quantification of proteins and transcripts in single cells” 中同时使用了 82 种寡核苷酸偶联的抗体。作者没有使用偶联好的 TotalSeq™抗体，使用的方案也被称为 REAP-seq，但其原理与 CITE-seq 非常相似，所以同一样本共染更多的 Totalseq 抗体也是可能的。
FAQ17: 是否可以将荧光偶联的抗体与寡核苷酸偶联的抗体同时标记细胞，然后再流式分选后再进行 CITE-Seq? 寡核苷酸耦合能否经受分选的影响？
寡核苷酸可以经受分选的影响。但是，基于理论考虑而言，我们建议两种抗体使用两种非竞争性的克隆，以最大程度减少对 FACS 信号或测序信息读取。尽管抗体偶合物暴露在激光中的时间很短，我们尚未评估过紫外线或紫激光对寡聚物的影响。当然，还有其它替代流式的细胞分选方案是磁珠富集，例如我们的 MojoSort™平台。
FAQ18: 什么是 TotalSeq™? TotalSeq™如何与已建立的工作流程 (CITE-seq 和 REAP-seq) 一起使用？
TotalSeq™是 BioLegend 的抗体 - 寡核苷酸耦合物的品牌商标，用于在单细胞水平同时分析蛋白质和 mRNA。而 CITE-seq 和 REAP-seq 是同时进行蛋白质和 mRNA 分析的两个相似工作流程，并且 TotalSeq™适配于这些系统的。
FAQ19: TotalSeq™-A、-B 和 - C 有什么区别？
3 者的主要区别是标记的寡核苷酸序列以及与之对应的下游单细胞测序平台存在差异：
TotalSeq™-A: 与任何依赖 poly (dT) 寡核苷酸作为 mRNA 捕获方法的单细胞平台兼容，也和 10x Genomics Chromium 单细胞表达谱分析解决方案兼容 (3' 测序)；
TotalSeq™-B: 和 10x Genomics Chromium 单细胞表达谱分析解决方案兼容 (3' 测序)；
TotalSeq™-C: 与 10x Genomics 的 Chromium 单细胞免疫谱分析解决方案兼容 (5', V (D) J 测序)；
TotalSeq™-A、-B 和 - C 的产品各自使用不同的引物进行文库扩增，您可以在我们的 TotalSeq™网页上阅读更多关于差异的内容。
FAQ20: TotalSeq™-A 和 - B 可以一起使用吗？
目前 BioLegend 还没有办法对单个实验中混合使用 TotalSeq™-A 和 TotalSeq™-B 的实验提供技术支持。这两类产品需要不同的文库制备方案，不同的捕获方法可能会导致捕获效率存在差异。此外，在数据分析时，由于索引 (index) 序列和长度存在的变化，也可能影响下游的对蛋白表达的生信分析。虽然理论上 TotalSeq™-A 和 - B 可以一起使用，但在实际过程中可能困难重重，所以我们建议尽可能不要一起用。
FAQ21: 可以在 10x Genomics 3’ Single Cell Gene 平台上使用 TotalSeq™-A 吗，还是需要用 TotalSeq™-B?
这两者都可以正常工作。
FAQ22: 什么是 “features”?
在分析单细胞数据时，特征意味着所检测的细胞的任何方面。共同特征是 mRNA、蛋白、sgRNA 等。
FAQ23: 10x Genomics 是否支持 TotalSeq™-A、B 和 C?
TotalSeq™-A/B/C 产品是完全由 BioLegend 研发的，并已由 BioLegend 在 10x Genomics 平台上进行了内部测试。10x Genomics 完全支持 TotalSeq™-B 和 C，部分支持 TotalSeq™-A。
如果您有任何不确定的问题，请随时联系 BioLegend 技术团队，我们将与我们的合作伙伴一起解决您的问题。
FAQ24: 什么是 “super loading”?
通常情况下，当使用单细胞平台时，随着检测的细胞数量的增加，doublet (两个细胞被当成一个数据捕获) 的概率增加。这会导致检测的单细胞比例值达不到检测要求。Hashtags 可以 “super load” 检测的细胞数。同一检测样本等分为多个样本后和 hashtags 混合染色。等分的分数可能和每一份中细胞的数量不同，但在清洗和混合细胞后，按照染色和分析方案，如果在单个细胞 “event” 中检测到一个以上的 hashtag, 则该 event 可以作为 doublet 丢弃。虽然这并不能消除包含在相同 hashtag 中的 doublet，但 doublet 检测率仍然大大增加。然而，“super loading” 细胞量应当控制在一定范围，因为细胞越多，发生的 doublet 就越多，导致整体回报递减。多样本优化、单细胞数量和最佳仪器 / 平台性能之间应保持平衡。
FAQ25: 什么是 nuclear hashtags?
nuclear hashtags 应用于单核 RNA-seq (snRNA-seq) 样本。snRNA-seq 能够捕获与细胞核分离的 RNA。这样做是因为由于特定的实验或样品条件，整个完整的细胞可能很难分离，或者很难解决某个科学问题。在这个链接中可以参考 nuclear hashtags 的应用示例:https://www.nature.com/articles/s41467-019-10756-2
FAQ26: 可以使用 nuclear hashtags 进行单细胞 ATAC-seq 吗？
TotalSeq™试剂盒目前并不与单一的 ATAC-seq 试剂盒直接兼容。然而，NYGC 开创了一种桥接方法 ——ATAC 与测序选择抗原分析 (ASAP-seq)，能够将 TotalSeq™抗体与其他检测平台如 scATAC-seq 桥接。https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.09.08.286914v1
但是，我们有 nuclear hashtag 产品，目前没有针对该应用的推荐方案。我们可以为您提供一些参考文献，例如本文献: https://www.nature.com/articles/s41467-019-10756-2
FAQ27: 在使用 hashtags 时，可以获得技术支持吗？
Hashtags 可以在包括 10x Genomics 平台在内的任何单细胞测序平台中使用。BioLegend 完全提供 hashtags 使用的技术支持。如需了解更多信息，请联系我们的技术服务组。
FAQ28: 可以在 bulk RNA-seq 实验中使用 TotalSeq™产品吗？
这是可行的，现在 Illumina 和 BioLegend 之间已经合作开发出了同时进行总量蛋白和核酸测序 (BEN-seq) 的方案。您可以在我们的官网中阅读更多信息。
FAQ29: ADT/HTO 库的测序深度应该是多少？
我们推荐 5000 个 reads/cell 的测序深度，如果您使用的 TotalSeq™抗体超过 100 个，应该增加到 10000 个 reads/cell，但是如果仅 HTOs，500 个 reads/cell 就足够了。
FAQ30: 需要同型对照吗？
我们建议但不强行要求您使用同型对照。同型对照在这些应用中的效用是，它们可以帮助我们识别由活力受损的细胞引起的 “粘性细胞”。同时，通过同型对照还能了解不同细胞的背景水平或非特异性结合的全貌。通常情况下，当在 CITE-seq 实验中使用同种型对照时，无论有多少抗体，都希望检测板中包含的每个同型都有 1 个同型对照。因此建议使用与样本组中使用的单一抗体的最高浓度相匹配的浓度的同型对照，用于特定的同型。通常，同型对照应与样本在同一试管中使用。与传统的流式细胞术实验不同，多组学细胞表征的同型对照不需要设置自己单独的 panel 进行比较。我们的 TotalSeq™通用混合抗体中已经包含同种型对照。
对照物的另一个用处是帮助识别细胞中已知的不结合任何抗体的阳性信号。例如，在表征人类样本时，只要抗体在小鼠和人类靶标之间不发生交叉反应，则为鼠细胞。当然，这不是识别阳性信号所必需的。
FAQ31: 实验方案中，应该用硫酸葡聚糖来阻断吗？
在一些基因组学方案，包括一些来自 10x genomics 的方案中，可能建议硫酸葡聚糖作为阻断剂，以防止核酸和其他带正电荷的分子之间不必要的电荷相互作用。然而，我们发现，在某些情况下，加入硫酸葡聚糖会干扰抗体结合和识别，我们不建议将其与我们的任何 TotalSeq™试剂一起使用。虽然目前尚不清楚导致该问题的确切作用机制。但我们的所有方案均反映了这一观察结果；因此我们不建议使用硫酸葡聚糖。
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