【Biolegend】TotalSeq™ Antibody Oligonucleotide Conjugates

●同时产生多重数据：同时获得细胞表面抗原信息和 mRNA 信息；

●降低假阴性：可以改善单细胞 RNA 测序中的 dropout 问题；

●增强细胞类型的识别：改善基于 mRNA 测序结果中聚类分析某些细胞群体时分群不明显的状况；

●高阶多色流式：细胞表面抗原高通量检测，能够同时检测一百多个 markers，并且指标间的干扰更小：跳出流式荧光素 / 补偿限制；

▍▏TotalSeq™ Antibody Oligonucleotide Conjugates
高通量单细胞蛋白基因组学相关产品

随着第二代高通量测序和基于液滴的微流控技术不断进步，使得能够通过高通量单细胞 RNA 测序技术 (scRNA - seq) 从数千个单细胞中获得转录组数据。最近，10x Genomics 单细胞 3' 转录组测序技术促使 scRNA - seq 在生物医学研究中被广泛使用，该技术有望加快精准医疗的快速发展。虽然蛋白信息在生物研究中至关重要，但是之前的技术却不能在提供转录组信息的同时提供蛋白信息。为此，BioLegend 隆重推出 TotalSeq™系列产品。该产品可以满足转录信息和蛋白信息的同时高通量检测，旨在促进生物医学的快速发展。

同时产生多重数据：通过增加蛋白组数据和转录组数据来增强单细胞实验的说服力。

降低假阴性：与 mRNA 相比，TotalSeq™不容易发生信号丢失，造成假阴性的结果。

增强细胞类型的识别：通过减少标签信号丢失来增强样本聚类。

• 个性化或精准医疗

• 癌症研究

• 干细胞研究

• 基础与应用免疫学

• 生物标志物的发现

• 新细胞与稀有细胞类型研究

• 神经免疫学

• 疫苗研究

▍▏TotalSeq™ 产品适合用于全面分析细胞生理进程

TotalSeq™-A 寡聚核苷酸偶联抗体是我们最早用于蛋白基因组学研究的试剂产品，设计用于依赖 poly-dT 作为 mRNA 捕获的方法 (scRNA-seq) 的单细胞测序平台。由于寡聚核苷酸抗体偶联物有一个 polyA 尾巴，它能通过模拟天然 mRNA 的结构整合入 scRNA-seq 的工作流程中。寡聚核苷酸抗体偶合物包含一个与克隆对应的 barcode 和一个 PCR handle，使得它与 Illumina® 测序试剂和仪器有着更好的兼容性。

我们致力于研发兼容性更好的产品并且支持最新的基因组学技术，例如来自于 10x Genomics 公司的 Feature Barcoding technology。TotalSeq™ B 与 Chromium™ 的 Single Cell Gene Expression Solution (v3) 完美兼容。此外，适应性免疫反应对疫苗以及癌症研究起到了至关重要作用。为实现这一目标，T 细胞和 B 细胞相关的单细胞测序越来越多，因为这些关键的细胞在很大程度上决定着健康与疾病的平衡。为了支持这个领域的研究，我们又推出了 TotalSeq™ C，这些抗体可以更好的与 Chromium™ 的 single cell immune Profiling Solution 兼容。

▍▏TotalSeq™-Enabled Seamless Workflow

1.Stain cells with TotalSeq™ reagents

2.Transfer labelled cells containing Antibody-Derived Tags (ADT, antibody-oligo conjugates) into any poly-A compatible single cell RNA sequencing platform

3.Separate ADT-derived cDNA from mRNA-derived cDNA

4.Amplify both cDNA libraries independently

5.Mix libraries at desired proportions and sequence on the same lane

在 scRNA-seq (单细胞测序) 平台的基础上，BioLegend 的 TotalSeq™系列产品可以使用户同时得到转录组信息和免疫表型信息。除此之外，TotalSeq™系列产品中独特的 Cell Hashing 抗体还可以帮助用户实现多重样本的检测。该方法由我们的细胞 Hashtag 试剂来帮助实现，该试剂含有识别普遍表达的细胞表面标志物的抗体池。

对于人的样本，Hashtag 试剂识别 CD298 以及 β2 microglobulin，它们被被标记上同样的唯一的 DNA barcode；而小鼠样本的 Cell Hashtag 抗体识别 CD45 以及 H-2 MHC class I，它们也被标记上独特的 barcode。

偶联抗体已经被预先混合并可立即使用。

Hashtag 不仅可以优化工作流程以及复杂的实验条件，还可以优化 TotalSeq™抗体的使用，TotalSeq™抗体滴定可采用间接法和直接法进行：

使用和 TotalSeq™克隆号相同的抗体偶联 PE 荧光素，利用流式实验可以计算出抗体的最优用量。流式抗体的最终用量也可以直接换算为 TotalSeq™抗体的用量。

使用二抗进行滴定， 例如用 poly-dT 寡聚核苷酸偶联荧光基团 (例如偶联 Alexa Fluor®647), 或用 PE 标记二抗进行滴定检测。

用测序进行滴定价格比较昂贵，但使用 Hashtags 可以优化检测步骤从而节约成本。

▍▏多个样本合并的单细胞核转录组测序 - 核孔蛋白复合物 Nuclear Hashtag

有一些冷冻样本、难消化样本，直径较大的样本可以直接抽提细胞核进行单细胞核转录组测序，且这种单细胞核转录组测序结果和单细胞转录组测序结果保持高度的一致性。抽提的细胞核可以通过核孔蛋白复合物 Hashtag 来实现多个样本合而为一。

使用几种耦联了不同 DNA barcode 的抗核孔复合物抗体（clone MAb414），分别和几个冰冻样本中抽提的细胞核进行孵育，这样不同的样本就间接标记了专属的 DNA barcode 序列，孵育完成后再把几个样本混合在一起做为一个样本进入单细胞测序平台。由于一种抗体上的 DNA barcode 序列代表一种样本，不同样本标记了不同的 DNA barcode，所以即使将多个样本混合在一起，也可以在测序完成后通过生信分析很轻松的再把每个样本分离开。这样就实现多个样本合并的单细胞核转录组测序了。（Nuclei multiplexing with barcoded antibodies for single-nucleus genomics. Jellert T Gaublomme et al. Nat Commun. 2019）

这种多个样本合并的单细胞核转录组测序新技术有什么令人惊喜的优势呢？

1、合而为一：同时获得多个样品的转录组信息，最大化信息量；

2、尽可能减少误差（批次效应，操作因素，仪器设备等）；

3、优化单细胞测序流程，排除多细胞干扰。

免疫系统的监测：TBNK panel

TBNK 等淋巴细胞亚群的变化与多种疾病的发生、发展、预后密切相关；国家卫计委也把淋巴细胞亚群的监测写进了《新型冠状病毒诊疗方案》。
TotalSeq™ Human TBNK Cocktail 是 BioLegend 专门为单细胞测序设计的 panel。相比单独购买的抗体，这些 panel 的好处可不是一点两点，而是好几点：

• 一支抗体就是一个反应，使用方便；

• 预先滴定，确保最适浓度，操作更简便；

• 相比单独购买，价格更优惠；

• 减少非实验变量对结果的影响，保持实验结果的长期稳定。

▍▏TotalSeq™用于抗原表位及中和抗体筛查

四聚体技术在疫苗研发及使用监控中发挥重要作用，若结合使用 TotalSeq™即可使用高通量手段高效地鉴定和筛选 T 细胞特异性抗原表位，尤其是针对研发前期的疫苗抗原表位设计。

常规的四聚体结构中 Streptavidin 其标记物为荧光基团，和 biotin 化的 MHC 组合为四聚体后，可用于标记抗原特异性的 T 细胞进行流式分析 / 分选。

在相应的 TotalSeq™抗体中则是在 Streptavidin 上标记含有特定 Barcode 的 Oligo (Streptavidin-Oligo)，可在单细胞测序后对抗原特异性 T 细胞进行特异性分析；或者同时标记 Oligo 和荧光基团 (Streptavidin-PE-Oligo)，可以先用流式对抗原特异性 T 细胞进行富集，再进入单细胞测序平台，从而分析抗原特异性 T 细胞相应的抗原肽表位。

无需考虑荧光素种类的限制以及在使用流式细胞仪的补偿问题等，可极大地提高抗原表位筛选通量；

使用 Streptavidin-PE-Oligo 结合的 Tretramer 标记细胞后可先经流式细胞仪进行富集后再进行后续的高通量分析；

可对同一份样本中所有感兴趣的抗原特异性 T 细胞同时进行转录组分析，通过 Oligo 区分不同 T 细胞。

注：对于特异性 B 细胞的研究，也可以通过抗原四聚体检测 BCR。若 Antigen 上偶连了 biotin，那么也可通过 Streptavidin-PE-Oligo 结合，形成 Antigen-biotin-Streptavidin-(PE)-Oligo 复合物（抗原四聚体），然后进入到测序平台，从而进行特异性抗原标记进行抗体大规模筛选。

包含 137 种抗体的 Universal cocktail 的产品特点

TotalSeq™-C 系列人源通用抗体库，可与 130 种独特的细胞表面抗原（包含了人类主要谱系抗原）反应，并包含 7 种同型对照抗体，帮助研究者对免疫细胞进行多组学鉴定。

优点：

• 每 test 一支装，冻干粉形式，使用方便；

• 预先滴定，确保最适浓度，操作更简便；

• 130 个抗体预混，减少非实验变量对结果的影响，保持实验结果的长期稳定；

• 相比单独购买，价格更优惠；

• 直接包含同型抗体，不需要自己额外搭配同型。

▍▏使用 BEN-seq 实现高维分析

BEN-seq (bulk epitope and nucleic acid sequencing) 将寡核苷酸偶联抗体整合到 RNA-seq 工作流程中，同时获得 RNA 和蛋白质数据，有利于绘制样本的完整蛋白质基因组学图谱。

为了证明这种方法的实用性，Biolegend 用 280 个 TotalSeq™抗体对 Th1 极化的人外周血单核细胞进行了 CITE-seq 和大量 RNA 和蛋白测序。发现两种方法具有非常强的相关性，在实验中展示了如何将蛋白质分析应用于 bulk RNA-seq 数据集。您可以在我们的 TotalSeq™网页上阅读更多实验的内容。

▍▏TotalSeq™-D 抗体

通过寡核苷酸标记的 TotalSeq™-D 检测得到蛋白信息，并将其与单细胞测序分析数据结合起来，可以解决从基因型到表型的复杂遗传问题。单细胞测序通过提高灵敏度并能够解析异质样品中不同基因型，克服了批量测序带来的许多局限性，这对于探索癌症等复杂疾病的机理是至关重要的。通过额外对蛋白质表达的检测，提高检测能力，并具有以下优势：

• 同时进行免疫表型分析以确定突变是否与特定细胞类型或状态相关

• 发现新的靶点

• 通过同时共同检测 SNVs/indel、CNVs 和蛋白质，将基因型与表型联系起来

使用 Mission Bio 的 Tapestri 平台揭示异质样本的遗传变异，并添加 BioLegend 的 TotalSeq™-D 抗体，将这些突变与蛋白表达相关联。

TotalSeq™-D 产品的构建与 Mission Bio Tapestri 平台兼容。每种抗体与寡核苷酸偶联，而寡核苷酸由捕获序列、克隆特异性条形码序列和与 Illumina® 测序平台兼容的 PCR handle 组成。

TotalSeq™-D Heme Oncology Cocktail v1.0 即将被生产出来，其包含 42 个一抗和 3 个同型对照抗体。厂家已对每种抗体进行了预滴定，以获得最佳性能，抗体混合物被混合在一个试管中，方便适用。

如需获得更多资讯，请在官网注册电子邮件，将及时了解 TotalSeq™-D 抗体的产品使用信息。
https://www.biolegend.com/en-us/totalseq/single-cell-dna

TotalSeq™产品线质量我们承诺：

所有批次 TotalSeq™的产品的每个抗体上都会共轭 1 个或 2 个寡核苷酸，并且该产品中不含有未结合寡核苷酸的抗体。同时，我们对所有批次的抗体进行了测序，以确保正确的 oligo barcode，并且只有精确的 barcode 连接到抗体上。

• 本产品仅供研究使用，不可用于临床诊断与治疗。

• Alexa Fluor® 是生命科技公司的注册商标。

• Chromium™是 10x Genomics 公司的注册商标。

• TotalSeq™是 BioLegend 公司的注册商标。