【BioLegend】Flex-T™ 产品FAQ
1.Q: 什么是 MHC 四聚体，有什么作用？
A: T 细胞介导的先天性免疫应答是由抗原提呈细胞和 T 细胞之间通过主要组织相容性复合物（MHC）和 T 细胞受体（TCR）的相互作用决定的。MHC 分子递呈抗原肽给识别这种肽的抗原特异性 T 细胞。可溶的单体 MHC 分子与 TCR 的结合非常弱。然而，通过荧光标记的链霉亲和素可制备成四聚体，四聚体复合物就会与几个 TCR 结合，产生更稳定的相互作用，便可用流式细胞术检测抗原特异性 T 细胞。
2.Q: 什么是 Flex-T™ ？
A: Flex-T™ (Flexible-Tetramers) 是 BioLegend 公司可溶性 MHC 产品线商标。它包括单体、紫外线（UV）肽交换技术以及所有相关产品和应用。
3.Q: 购买生物素化单体的好处是？
A: 相同的单体可以与不同的荧光素标记的链霉亲和素组装在一起，为荧光素的选择提供了极大的灵活性。此外，它可以冷冻保存，并在实验前组装四聚体，增加了试剂的储存时间。
4.Q: 肽交换技术是什么？采用的好处是？
A: Flex-T™ MHC 单体预载的 UV 敏感肽是可以被紫外光降解的。当紫外线照射时，溶液中如果同时存在您感兴趣的肽（该肽不是紫外不稳定的），就会发生肽交换。这种灵活性允许筛选几乎任何对 MHC 等位基因有足够亲和力的肽。
5.Q: 紫外灯是否有特殊要求？
A: 建议用长波段的紫外灯（366nm）。短波紫外灯（254nm）或者广谱紫外灯会损伤 MHC 复合物。从溶液到光源的距离应为 2-5cm。
6.Q: UV only 对照是否必需？它的作用是什么？
A: 建议每次都加入 UV only 对照，它可以用于指示紫外灯照射效率。正常的 UV only 组的 ELISA OD 值应该与 negative peptide 对照相似或略低于 negative peptide。
7.Q: UV - 不稳定肽的序列是否必须知道？
A: 使用 Flex-T™试剂不需要知道 UV 不稳定肽的序列。当没有肽时，MHC 分子是不稳定的，因此这些肽仅用于两个目的：一是稳定 MHC 分子，二是为待交换的目的肽占据结合位点。
8.Q: 对多肽长度有建议吗？
A: 对肽没有特殊要求。可自然结合到 MHC 分子的肽也会与 Flex-T™试剂结合。对于 MHC I，典型长度约为 8 - 10 个氨基酸。MHC II 可容纳较长的肽，约 14 - 20 个氨基酸。
1) Mohan JF and Unanue ER. Unconventional recognition of peptides by T cells and the implications for autoimmunity. Nat Rev Immunol. 2012 Oct;12(10):721-8.
9.Q: 我想研究新的多肽，有相关资源推荐吗？
a. 已知常见抗原特异性多肽（癌症、感染性疾病、器官移植、自身免疫疾病）
https://www.biolegend.com/antigen_peptides
b. 预测肽段与 MHC class I 结合的网站资源
http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCpan-4.0/
（Copenhagen 商学院免疫学院以、Copenhagen 大学微生物学院、以及La Jolla 学会过敏与免疫分会合作开发的 ANN（人工神经网络）
c. 已发表的多肽数据库资源
https://www.iedb.org/home_v3.php
（The Immune Epitope Database （IEDB) 是来自 NIAID 的开放免费预测和分析表位肽的数据库资源，数据库收集了各种实验数据，包括已发表的数据，如感染性疾病、过敏、自身免疫疾病及移植等 T 细胞和抗体表位的系列研究。
10.Q: 若按照 Biolegend 的四聚体组装 protocol，一次用不完这么多的四聚体（15test），有什么建议？
A: 按 1/4 浓度的 monomer 及 peptide 进行交换实验，相应的，positive peptide、negative peptide 及 UV only 组也用 1/4 浓度以保证一致性。但是需要注意的是，若后续需要进行 Flex-T™ ELISA 实验 peptide-exchanged monomer 进行 1:350 倍稀释，而非 1:1200 倍稀释进行测试。
11.Q: 如何评估肽交换的效率？
A: 使用 HLA class I ELISA 或者 LEGEND MAX™ Flex-T™ Human Class I Peptide Exchange ELISA (Cat#280301) 进行检测。前者将 Streptavidin 包被 Elisa 板子，基于 Streptavdin &Biotin 的特异性结合原理，可单独购买阳性多肽 (280301)；后者将 anti-human β2 Microglobin 包被在板子，基于三明治夹心结构。阳性多肽可以被稀释成高、中、低三个不同浓度，其产生的信号强度对应于多肽的不同程度亲和力。
12.Q: 已置换好目的肽段的 Monomer，可以长时间放置吗？
A: 建议在肽交换后立即对样品进行分析。如果不立即进行分析，样品可以在 2 - 8 度，密封板或管中避光储存 48 小时。样品不建议冻融。
13.Q: 用 ELISA 试剂盒检测评估抗原肽交换效率实验中，样品为紫外下抗原肽交换单体，有无浓度要求？
A: 一般情况下，建议所有样品的浓度为 5 ng/mL。例如，如果交换后样品浓度为 25μg/mL，建议用 Assay Buffer A 做两步稀释 (total 1:5000)。首先，将 2μL 样品加入 198 μL Assay Buffer A 中即为 1:100 稀释，然后制备 1:100 稀释样品的 1:50 稀释液（例如，从 1:100 稀释样品取 4μL 加入 196μL Assay Buffer A 中）。如需要进一步稀释，应使用 Assay Buffer A 连续进行稀释。
14.Q: ELISA 实验中的 positive control 和 negative control 客户是否可以自己合成？
A: 可以。各种 allele 的阳性对照及阴性对照多肽序列请参考 Biolegend 官网。
15.Q: 有什么方法可以提高四聚体染色的特异性？
A: 使用两种荧光素标记的同一种 tetramer，上机检测时分析仅双阳性的群体。
16.Q: 可定制产品包括哪些？如何定制？
A: 目前可定制人（HLA) 及小鼠的 Monomer 和 Tetramer; https://www.biolegend.com/custom_flex-t17.
17.Q: 在一个样本中不仅要筛选抗原特异性 T 细胞，还要分析 T 细胞的抗原多态性，是否可行？
A: 传统的预组装四聚体是很难做到的，且成本高。而 Flex-T™技术可以灵活地组装不同地四聚体，同时结合 “combinatorial color coding”，可以针对同一份样本筛选多种多肽，不仅简单易操作且性价比高。
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