【Wako】新型组织化学染色脱色法
新型组织化学染色脱色法
本文摘自和光纯药时报 Vol.87 No.4（2019年10月号），
由麻布大学兽医学部 解剖第二研究室 小泽秋沙执笔撰写。
本法是一种可使临床检查或研究中最常用的组织化学染色苏木精-伊红（HE）或Masson法（MT）染色的组织切片脱色，并可重新用于其他染色的方法。
迄今为止，每一种组织化学染色通常都需要使用至少一片组织切片，因此必须准备与组织化学染色方法相对应数量的组织切片。然而，由于制备组织切片时的技术熟练度以及组织样品状态、大小等原因，有时很难备齐多个适合评价的组织切片。另外，在评价同一细胞时一般使用连续切片的方法，然而即使获得了合适的连续切片，想要观察的组织结构和细胞内结构，也可能不同时存在于两个相邻的组织切片上。
在这种情况下，重复利用已有观察特征的细胞或结构的组织切片就会十分有用。HE染色可获取组织大致特征，因此是首次染色的代表染色法之一，如果可以对HE染色后的目标结构的组织切片进行重新染色，便可以提高临床检查以及研究结果的准确性。
至今为止，组织切片脱色通常使用乙醇与盐酸的混合溶液、含有草酸、高锰酸钾的溶液。然而，这些脱色方法都会影响组织切片在脱色后的再染色效果。
实际上，在乙醇中加入盐酸的溶液不能对苏木精等染料充分脱色。而通过高锰酸钾、草酸脱色则会对组织切片造成很大的损害，重新染色时组织结构可能会因为切片剥离被破坏，从而限定了再染色的方法，也限制了组织切片的再利用。因此，学界期待开发一种几乎不会损害组织切片，并且可以对多种染色法进行脱色后再染色的全新方法。
这次，FUJIFILM Wako开发的deColorizing Solution，可以对HE染色后确认了组织状态（特定的结构及细胞的存在）的切片脱色，再重新用于其他染色，从而能够从同一组织切片中获得更多信息。该方法的特点在于可以对原本难以脱色的苏木精、铁苏木精进行脱色。
使用方法：首先将染色后密封的载玻片标本浸入二甲苯等有机溶剂中，直至盖玻片自然剥落。请注意，在此过程中若是强行分离盖玻片可能会破坏组织切片。
另外，若在组织切片上仍然残留有封固剂的状态下就进行下一步骤，水溶性色素在水合后不会脱落，会降低随后使用deColorizing Solution进行脱色的效果，因此必须使用二甲苯等有机溶剂充分浸泡。必须注意的是，标本越旧，封固剂的固化越牢固，封固剂就越难去除。
其次，将组织切片依次用各种浓度的乙醇进行水合，最后浸入蒸馏水中。在水合过程中，伊红等水溶性色素基本脱色，组织切片上仅残留染色的苏木精。将残留苏木精染色的组织切片浸入按照使用浓度稀释的deColorizing Solution 1中。脱色主要取决于组织切片染色后保存的时长，但苏木精在室温下于deColorizing Solution 1中浸渍1 h基本就能脱色。
铁苏木精脱色时需要在deColorizing Solution 1中浸渍1 h后使用蒸馏水清洗3次，然后浸渍于deColorizing Solution 2。通过光学显微镜确认脱色程度（染色残留情况），确认不会影响下次染色后，浸渍于蒸馏水并清洗3次，这时可用于重新染色。
目前，在使用deColorizing Solution脱色后，可以使用的再染色方法已确认的有HE染色、PAS染色、MT染色和免疫组织化学染色。
图1和图2分别是小鼠海马体以及肝脏在HE染色后使用deColorizing Solution按照上述步骤脱色后的图片。如图１A及图２A所见，包括细胞核在内，被苏木精染色的部分在图1B及图2B中大部分已被脱色。
另外，图3为小鼠肝脏以及肾脏在MT染色后使用deColorizing Solution 1和2脱色后的图像。图3A和C中包括细胞核在内，被铁苏木精染色的大部分在图3B和D中均已完全脱色。
图3. 使用deColorizing Solution 1和2对MT 染色后的组织切片脱色
A：MT染色后的小鼠肝脏组织图像
B：使用deColorizing Solution 1和2脱色后与A相同位置的组织图像
C：MT染色后的小鼠肾脏的组织图像
D：使用deColorizing Solution 1和2脱色后与C相同位置的组织图像
图1C为小鼠海马体脱色后使用抗Iba1抗体（FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation）进行免疫组织化学染色的图片，图1A和B为同一位置的图像。如图可见，脱色后的海马体切片仍然可以检测出Iba1阳性小胶质细胞突起。图2C为小鼠肝脏脱色后使用抗PCNA抗体进行免疫组织化学染色的图片。如图可见，阳性PCNA主要在肝细胞的细胞核中表达。
另外，并未发现因脱色导致的组织切片破坏等损伤。
该方法的优点在于，大量长期保存在大学、研究所、医院等的珍稀组织切片，在制备时没有新型染色方法以及针对新型抗原的抗体，通过再染色等方法可以重新评价以获取新的实验信息。
目前，deColorizing Solution的应用只适用于HE 染色和MT 染色后的脱色，但随着该方法的应用范围拓展，脱色法在重复使用组织切片方面的实用性将进一步提高。
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