【Tymora】pIMAGO for Phosphoprotein Detection on Western Blot Kit (800-10)
产品/货号 | pIMAGO-biotin Phosphoprotein Deteetion kit For Western Blot, HRP-based deteetion (ECL), Cat:800-10 |
试剂盒成分 | ●100μL of pIMAGO reagent |
●100μL of avidin-HRP | |
● 500μL of 5x IAA | |
● 20mL of 10x Biocking buffer | |
● 20mL of 5x pIMAGO buffer | |
● 60mL of 10x Washing buffer | |
● 100μL of control phosphoprotein |
pIMAGO是一种通用的磷酸化蛋白检测技术，能够灵敏、特异地识别磷酸化分子。与磷酸化抗体不同，结合不受氨基酸序列的影响,因此可用于检测任何蛋白质位点上的任何磷酸化事件。pIMAGO检测方案类似于一个简单的Western印迹程序，可以方便地纳入任何实验室。
使用方法
▍▏试剂
●10 x Biocking buffer（需要用DI水稀释至1x；在4下储存10倍和1倍缓冲液）
●5 x pIMAGO buffer（需用DI水稀释至1x；储存于4-25°C）
● 10x Washing buffer（需用DI水稀释至1倍；贮存于4-25°C）
● 5x IAA（储存在4°C）
● pIMAGO reagent（储存在4°C）
● avidin-HRP（如果是基于ECL的检测，储存在4°C）
● avidin-Fluro（如果是基于荧光检测，储存在4°C）
● 需要准备：1xTBST(含0.1%吐温20的Tris缓冲盐溶液)
▍▏操作指南
① 跑胶前，将样品在SDS/DTT中煮沸并冷却至室温。直接将5xIAA溶液加入到样品中至0.5x~1x的最终浓度，避光孵育15分钟（这一步是可选，可提高磷酸化特异性）。将样本点如凝胶中。用10uL提供的磷蛋白作为阳性对照，装入一个孔（按原样装入，不需要煮沸）。
② 运行样品并转移到膜上（Tris-Glycine转膜缓冲液可提供最干净的结
*如果需要进行基于荧光的检测，请使用具有低自体荧光的特殊膜。
*重要提示：在许多情况下，转膜系统本身可能含有污染物，增加非特异性背景信号。为了减少这种情况，强烈建议在凝胶前加入第二片膜，以结合这些污染物。(建议设置：过滤垫-膜-凝胶-膜-过滤垫)。硝酸纤维素膜不需要。
③ 用1x封闭缓冲液封闭膜1小时（例如，10 mL用于迷你印迹；此步骤也可以在4°C过夜完成）。
④ 在1x pIMAGO缓冲液中制备1:1,000的pIMAGO试剂混合物（例如10uL pIMAGO在10 mL pIMAGO缓冲液中）)。混合后加入到膜中，孵育1小时。
⑤ 用10-20mL的1x洗涤缓冲液洗涤膜3次，用1xTBST洗涤膜1次（每次洗涤5分钟）。
⑥ 在1x封闭液中，按1:1,000的比例配制1x avidin-HRP或1x avidin-Fluro混合液（如10uL的avidin试剂加入10 mL的封闭缓冲液中以用于小凝胶）。混合后加入到膜中，孵育1小时。
⑦ 用1xTBST清洗膜3次（每次清洗5分钟）
⑧ 使用扫描仪或HRP化学发光衬底检测信号。（通常情况下，不需要曝光膜超过1-2分钟，以避免高背景；荧光检测时不需要干燥膜）。
注：对于硝酸纤维素膜，有时观察到HRP可能过快通过ECL底物而没有检测到信号。在这种情况下，用TBST冲洗膜，并添加更多的ECL底物进行重复检测。
点在看，传递你的品味
