【Wako】对去外泌体FBS中外泌体残留量的评估

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对去外泌体FBS中外泌体残留量的评估

富士胶片和光纯药

生命科学研究所笹本宏大

▍▏前言

由各种细胞释放的囊泡和外泌体，近年来不仅在理解生命现象的基础研究领域，而且在诊断和治疗等研究领域也备受关注。在获取和分析细胞培养来源的外泌体时，通常会使用添加了胎牛血清（Fetal Bovine Serum : FBS）的培养基。虽然使用的胎牛血清在细胞培养时已去除外泌体，但并没有详细验证过是否有外泌体残留，也没有讨论过对后续实验是否有影响。因此，本文介绍了使用FUJIFILM Wako的高灵敏度外泌体检测技术，对去除外泌体的FBS中外泌体残留量的结果进行了比较分析。

▍▏外泌体

外泌体是由细胞释放的直径为30-100 nm左右的膜囊泡，并将CD9、CD63和CD81作为标记蛋白¹）。外泌体含有蛋白质、核酸（DNA、RNA、miRNA）、以及脂质等细胞来源成分，研究认为它通过将这些成分传递给其他细胞来进行细胞间的信息传递。从它被释放至胞外的特点来看，可以确认在血液（血清和血浆）、尿液、唾液等体液中也存在外泌体。另外还有报告称外泌体可以作为癌症等疾病的生物标记，因此近几年的关注度明显攀升^2，3）。

▍▏关于外泌体研究中的FBS

在外泌体的研究中，分析时通常会使用培养上清中纯化获得的细胞来源外泌体。在一般的细胞培养中，经常会使用添加了FBS的培养基，但在以获取细胞来源外泌体为目的的培养中，为了防止混入FBS中大量的牛来源外泌体，会使用无血清培养基或已去除牛来源外泌体的FBS培养基。去除了外泌体的FBS，一般是使用自己用超速离心法去除外泌体的FBS，以及标明已去除牛来源外泌体的品牌。而且这一类产品的质量保证，是通过检测残留外泌体的粒子数和miRNA含量，以及使用Western blotting和ELISA试剂盒等检测标记蛋白来确认残留外泌体的数量。

▍▏利用PS亲和ELISA高灵敏度检测FBS中牛来源的外泌体

FUJIFILM Wako开发了PS亲和法可以用于外泌体的分离，此外PS亲和ELISA还可以进行外泌体的定量分析⁴），该方法的原理是利用存在于外泌体表面的磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine : PS），在钙离子存在下能结合Tim4蛋白。关于PS亲和ELISA，首先添加培养上清、血清等含外泌体的样品至固定了Tim4蛋白的孔板，接着在钙离子存在的条件下捕获外泌体，然后通过和外泌体表面标记蛋白反应的抗体进行检测。该方法的检测灵敏度约为Western blotting的1,000倍以上，约为固定了外泌体表面标记抗体的现有ELISA试剂盒（检测灵敏度为几ng~几μg左右）的100倍以上（图1）。

图1. 比较Western blotting与PS亲和ELISA检测的灵敏度

（a）PS亲和ELISA的原理：利用识别表面抗原的抗体来检测固定化Tim4蛋白捕获的外泌体并进行定量分析的方法。

（b）利用免疫印迹检测外泌体的灵敏度：分别取50、75、100、200 ng COLO201细胞来源纯化外泌体（使用MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS）进行电泳，使用抗CD63抗体进行Western blotting检测。检测下限在75 ng左右。

（c）PS亲和ELISA的检测范围：仅检测K562细胞和COLO201细胞来源纯化外泌体（使用MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS）梯度稀释后的样品和缓冲液的空白值的活性，然后根据检测结果，计算各样品的最低检测灵敏度（各浓度点在n=6、A0点在n=12时测定）。K562细胞来源外泌体的检测下限在49.9 pg，COLO201细胞来源外泌体在10.9 pg左右。

另外FUJIFILM Wako还对抗外泌体表面标记蛋白CD9、CD63、CD81的单克隆抗体进行了商品化。其中的抗CD9，单克隆抗体（1K）及抗CD81，单克隆抗体（17B1）均对牛抗原具有交叉性，利用上述PS亲和ELISA检测抗体，可高灵敏检测FBS中所含的牛来源外泌体。因此，这次FUJIFILM Wako使用高灵敏度外泌体检测技术，比较分析了超速离心处理去除外泌体后的FBS和其他品牌中已去外泌体FBS中牛来源外泌体的残留量（图2）。结果发现，众多论文所使用的产品，无论是使用超速离心法去除外泌体的FBS，还是其他声称已去除外泌体的2种产品，仍残留了大量的牛来源外泌体（图2（a）。

另一方面，实验也确认了FUJIFILM Wako准备在日本推出的BioSera品牌Exosome-Depleted FBS中，几乎没有检测到残留的牛来源外泌体（图2（a））。另外，在评价培养人胚胎肺来源的正常二倍体成纤维细胞（TIG3）的细胞增殖能力时，发现BioSera品牌的Exosome-Depleted FBS比起其他市售产品，拥有更好的细胞增殖能力（图2（b））。

图2. 去除外泌体FBS的评价

（a）使用PS亲和ELISA检测FBS中的牛来源外泌体：生物素标记抗CD9抗体（1K）、抗CD81抗体（17B1），然后用PS Capture™ Exosome ELISA Kit（ Streptavidin HRP）的检测抗体置换。使用的FBS分别是未经任何处理的样品、经超速离心处理的样品（120,000×g，18 h）、2种其他品牌去外泌体FBS、以及BioSera品牌Exosome-Depleted FBS的原液、10倍稀释产品和100倍稀释产品。信号值大于4，表示超出检测范围。

（b）评价去除外泌体的FBS的细胞增殖能力：添加10％浓度的各FBS（未经任何处理的样品、经超速离心处理的样品、2种其他品牌去外泌体FBS、和BioSera品牌Exosome-Depleted FBS）至D-MEM（低糖型）培养基中，然后培养TIG3 4天。计算接种3天后和4天后的活细胞数。

▍▏结语

本次我们通过高灵敏度的PS亲和ELISA和交叉性识别牛外泌体表面标记抗原蛋白的抗体的各种组合，确立了能高灵敏地检测FBS中牛来源外泌体残留量的检测系统。不仅发现了在普遍使用的去外泌体FBS中，仍残留着大量的牛来源外泌体，还发现了使用现有外泌体检测技术难以证明有无外泌体残留并保证产品质量。

当然，实验人员都会担心混入细胞培养上清中的牛来源外泌体会对下游的实验和分析的背景产生巨大的影响。因此，我们认为使用高灵敏度PS亲和ELISA可以确保高质量的FBS，或使用几乎完全去外泌体的BioSera品牌的Exosome-Depleted FBS，能够获取重复性良好且准确清晰的研究数据。最后，希望今后通过有效运用FUJIFILM Wako提供的高灵敏度PS亲和ELISA以及BioSera品牌的Exosome-Depleted FBS，为外泌体相关的研究做出贡献。

（备注：BioSera品牌Exosome-Depleted FBS尚未在中国地区出售）

▍▏参考文献

1) Colombo, M. et al. : Annu. Rev. Cell Dev. Biol., 30, 255 (2014).

2) Tkach, M. et al. : Cell, 164, 1226 (2016).

3) Raimondo, F. et al. : Proteomics, 11, 709 (2011).

4) Nakai, W. et al. : Sci. Rep., 6, 33935 (2016).

▍▏产品列表