【Cellntec】皮肤成纤维细胞的分离（Human Dermal Fibroblast Isolation）

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小白求助前辈指路

皮肤成纤维细胞分离不成功、实验做不出来怎么办？新手小白迫切求助，希望各位前辈在文章下方留言，分享自己的经验，为小白们答疑解惑！

皮肤成纤维细胞的分离

（Human Dermal Fibroblast Isolation）

本操作描述了使用CnT-PR-F培养基分离原代真皮成纤维细胞的方法。CnT-PR-F是一种先进的新型1%血清培养基，可提供更高的分离效率并促进细胞生长。通常，年轻的供体组织可以提供具有更强增殖能力的细胞。

操作步骤

1.将切除的包皮组织直接放入CnT-PR-F培养基中（50 mL离心管中加入15 mL培养基），4°C下存储，到傍晚开始分离。

2.将包皮放入培养皿中，使用手术刀将其切成4个相等大小的块。将组织块放入15 mL的离心管中（含有10 mL用CnT-PR-F稀释成1×的dispase溶液，以及2×G/A）。在4°C下水平放置，过夜孵育皮肤块（约16h）。

3.第二天将皮肤块连同dispase溶液转移到培养皿中。将每个皮肤块再转移到含有PBS的新培养皿中，以洗去多余的dispase。在皮肤浸入PBS的同时，用两对弯镊轻轻分离真皮（粉红色、不透明、黏稠）和表皮（白色、半透明），一只镊子固定组织，另一只镊子将表皮剥离。（如果不易分离，将组织放回含有dispase溶液的培养皿中，在室温下再处理30~60 min）。

4.使用无菌的手术刀刀片将真皮切成细块，将组织块转移到50 mL的离心管中（含有5 mL用CnT-PR-F溶解的浓度为1 mg/mL胶原酶A溶液，以及0.5倍G/A）。37°C孵育4~8 h，并偶尔轻柔混合（幼年的皮肤消化速度比成年皮肤快）。

5.加入15 mL的CnT-PR-F培养基，通过上下移液混合来稀释胶原酶。通过70 µm的细胞过滤器获得单细胞悬液。

6.200 g室温离心5分钟，弃除上清液，用1 mL CnT-PR-F重悬细胞沉淀。

7.细胞计数，并在CnT-PR-F中以约4,000 cells/cm²的密度接种，置于细胞培养箱中培养。

8.24~48 h后进行第一次培养基更换。随后每2-3天更换一次培养基。

9.可使用Accutase（参见通用培养方案）或Trypsin（配合适当的中和剂）进行细胞传代。为了获得最大的扩增速率，建议传代后的接种密度为1,000 cells/cm²。

表 1 Human Dermal Fibroblast 分离材料