【ScienCell】人肠平滑肌细胞(HISMC)产品使用攻略

【ScienCell】人肠平滑肌细胞(HISMC)产品使用攻略

小白求助 前辈指路


人肠平滑肌细胞培养不成功、实验做不出来怎么办?新手小白迫切求助,希望各位前辈在文章下方留言,分享自己的经验,为小白们答疑解惑!


人肠平滑肌细胞

(HISMC)

平滑肌收缩是胃肠运动中的基本事件,尽管激发-收缩耦合的许多生化机制尚未被定义,但已知细胞内钙离子是耦合现象中必不可少的成分。人类肠道的炎症引起平滑肌特异性肌动蛋白水平的增加,进而促进平滑肌层的增厚。此外,平滑肌肌动蛋白的增加可能影响力的产生,表明炎症肠道平滑肌细胞的可塑性。研究表明,HISMC可通过对IL-1β和TNF-α的刺激释放IL-6进而促进全身性炎症反应。HISM的培养使研究人体肠道平滑肌的收缩和增殖组织反应更具有可行性。

HISMC分离自人肠组织,其α-smooth muscle actin(α-SMA)特异性抗体免疫荧光染色呈阳性。


培养方式


培养瓶:PLL(多聚-L-赖氨酸)包被的培养瓶。

培养基:HISMC在提供的SMCM完全培养基(包含基础培养基、2% FBS、1% SMCGS和1% P/S)中培养。

操作步骤

1) 包被PLL(2 μg/cm2)培养瓶(T-75培养瓶)的准备:将10 mL无菌水加入到T-75培养瓶中,加入15 μL PLL原液,轻轻吹匀后将培养瓶放置在37°C的孵育箱中过夜(或至少1小时)。

2) 无菌水清洗包被PLL的T-75 2次,加入20 mL SMCM完全培养基(基础培养基、FBS、SMCGS和P/S按比例混合配制),将解冻后的HISMC加入至包被的T-75中,十字交叉法轻柔摇晃培养瓶使细胞分布均匀,将培养瓶放入细胞培养箱中。(注:不建议在解冻后稀释和离心细胞,因为这些操作对细胞的伤害比培养中残留的二甲基亚砜(DMSO)的影响更大。同时,细胞在PLL包被培养瓶中有助于促进细胞附着。)

换液:为了获得最佳结果,在培养开始后至少16小时内不要干扰培养。第二天更换培养基,以去除残留的二甲基亚砜和未附着的细胞,之后每隔三天更换一次培养基,直到培养达到约70%的密度,一旦培养达到约70%的密度,每隔一天更换一次培养基,直到培养达到约90%的密度。

传代:当细胞密度达到90%-95%时进行传代。

1) 将T/E、DPBS、培养基提前置于室温平衡(不建议37℃加热)。

2) 弃除旧培养基,并用DPBS清洗细胞后吸除加入5 mL DPBS和5 mL 0.05% T/E solution 轻柔晃动培养瓶后放入37℃培养箱(注:原代细胞传代时请勿使用未稀释的胰蛋白酶),一段时间后镜下观察,待细胞完全变圆、脱落,轻轻拍打底部和侧面,加入2 mL FBS(#0500)终止消化,将细胞悬液转移至15 mL离心管中,1000 rpm离心5 min,用新培养基重悬细胞沉淀后计数,根据5000 cells/cm2的密度传代至预先用PLL包被的培养瓶中。

生长条件

在CO2浓度为5%,温度为37℃,相对湿度(RH)为95%的细胞培养箱中培养。


表 1  HISMC培养材料


参考文献

[1] Blennerhassett MG, Bovell FM, Lourenssen S, McHugh KM. (1999) “Characteristics of inflammation-induced hypertrophy of rat intestinal smooth muscle cell.” Dig Dis Sci. 44(7):1265-72.

[2] Ng EK, Panesar N, Longo WE, Shapiro MJ, Kaminski DL, Tolman KC, Mazuski JE. (2003) “Human intestinal smooth muscle cells are potent producers of IL-6.” Mediators Inflamm. 12(1):3-8

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