【ScienCell】人肺间充质干细胞（HPMSC）产品使用攻略

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小白求助前辈指路

人肺间充质干细胞培养不成功、实验做不出来怎么办？新手小白迫切求助，希望各位前辈在文章下方留言，分享自己的经验，为小白们答疑解惑！

人肺间充质干细胞

（HPMSC）

间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSC）是一类特性良好的成体干细胞，具有发育成成熟细胞的潜能，可产生脂肪、软骨、骨、肌腱和肌肉。胎儿肺已被确定为MSC的丰富来源，研究表明MSC除了具有间充质分化潜能外，还可以分化为神经细胞。MSC也被证明可以增强人脐血来源的CD34造血细胞在免疫缺陷小鼠中的植入。

HPMSC分离自人肺组织，可通过CD73和CD90特异性抗体的免疫荧光进行鉴定，其成脂分化后油红O染色呈阳性，成骨分化后茜素红染色呈阳性。

培养方式

培养瓶：纤连蛋白（Bovine Plasma Fibronectin, 2 µg/cm²）包被培养瓶。

培养基：HPMSC用提供的MSCM完全培养基（包含基础培养基、5% FBS、1% MSCGS和1% P/S）培养。

操作步骤

1) 包被纤连蛋白（2 µg/cm²）培养瓶的准备（T-75培养瓶）：将10 mL无菌的Dulbecco's磷酸盐缓冲盐（DPBS）与150 µL纤连蛋白原液混匀后加入到T-75培养瓶中，将培养瓶放置在37°C的孵育箱中过夜（或至少2小时）。在铺细胞前将未凝固纤连蛋白溶液吸出（可重复使用2次），加入20 mL完全培养基（MSCM基础培养基、FBS、MSCGS和P/S按比例混合）。

2) 吸出未凝固的纤连蛋白溶液，T-75中加入20 mL的完全培养基，将解冻后的细胞小心加入到培养基中，十字交叉法轻柔平晃培养瓶。（注：不建议在解冻后对细胞进行稀释和离心，因为这些与培养物中残留DMSO的作用相比，这些作用对细胞的损伤更大；将HPMSC置于纤连蛋白包被的培养瓶中以促进生长。）

换液：培养开始后16小时内不要干扰培养。次日更换培养液，去除残留的DMSO和未贴壁细胞。之后每三天更换一次培养基，直到培养达到大约70%的密度。一旦培养达到大约70%的密度，每隔一天更换一次培养基，直到培养达到大约90%的密度。

传代：当细胞密度达到90%时进行传代。

1) 将T/E、包被培养瓶、DPBS、培养基提前置于室温平衡（不建议37℃加热）。

2) 弃除旧培养基，并用DPBS清洗细胞后吸除加入5 mL DPBS和5 mL 0.05% T/E solution 轻柔晃动培养瓶后放入37℃培养箱（注：原代细胞传代时请勿使用未稀释的胰蛋白酶），一段时间后镜下观察，待细胞完全变圆、脱落，轻轻拍打底部和侧面，加入2 mL FBS（#0500），将细胞悬液转移至15 mL离心管中，1000 rpm离心5 min，用新培养基重悬细胞沉淀后计数，根据5000 cells/cm²的密度传代至预先用纤连蛋白包被的培养瓶中。

生长条件

在CO₂浓度为5%，温度为37℃，相对湿度（RH）为95%的细胞培养箱中培养。

表 1 HPMSC培养材料

参考文献

[1] Fan CG, Tang FW, Zhang QJ, Lu SH, Liu HY, Zhao ZM, Liu B, Han ZB, Han ZC. (2005) “Characterization and neural differentiation of fetal lung mesenchymal stem cells.” Cell Transplant. 14: 311–321.

[2] Noort WA, Kruisselbrink AB, in’t Anker PS, Krugr M, van Bezooijen RL, de Paus RA, Heemskerk MH, Löwik CW, Falkenburg JH, Willemze R, Fibbe WE. (2002) “Mesenchymal stem cells promote engraftment of human umbilical cord blood-derived CD34(+) cells in NOD/SCID mice.” Exp Hematol. 30: 870-878.

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