【ScienCell】人真皮淋巴内皮细胞（HDLEC）产品使用攻略

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小白求助前辈指路

人真皮淋巴内皮细胞培养不成功、实验做不出来怎么办？新手小白迫切求助，希望各位前辈在文章下方留言，分享自己的经验，为小白们答疑解惑！

人真皮淋巴内皮细胞

（HDLEC）

淋巴系统是免疫系统的重要组成部分，与血管系统在维持组织稳态方面具有明确但互补的功能，包括间质蛋白质转运、组织液平衡、压力平衡和细胞免疫的发展。淋巴毛细血管牢固地融入间质，通过细小的弹性纤维束与细胞外基质连接，将组织中的多余液体运输到循环系统中，并由于缺乏连续的基底膜，具有高渗透性。原代人皮肤淋巴内皮细胞（HDLEC）是人皮肤内皮细胞的一个亚群，虽与血管内皮细胞具有众多共同特性，但它们具有反映特定功能的独特结构特征，其中，淋巴内皮细胞通常含有许多内陷和细胞质囊泡，以及特征性的重叠细胞间连接。淋巴内皮细胞参与淋巴系统的病理变化，并是肿瘤微环境的重要组成部分，在肿瘤淋巴血管生成过程中，淋巴内皮细胞构建新的血管，渗入肿瘤，促进肿瘤细胞的转移。HDLEC的vWF、podoplanin、CD31和Lyve1特异性抗体免疫荧光染色呈阳性。

HDLEC培养方式

培养瓶：纤连蛋白（Bovine Plasma Fibronectin，2 µg/cm²）包被培养瓶。

培养基：HDLEC用提供的ECM完全培养基（包含基础培养基、1% ECGS、5% FBS和1% P/S）培养。

操作步骤：

1) 包被纤连蛋白（2 µg/cm²）培养瓶的准备（T-75培养瓶）：将10 mL无菌的Dulbecco’s磷酸盐缓冲盐（DPBS）与150 µL纤连蛋白原液混匀后加入到T-75培养瓶中，将培养瓶放置在37°C的孵育箱中过夜（或至少2小时）。在铺细胞前将未凝固纤连蛋白溶液吸出（可重复使用2次），加入20 mL ECM完全培养基（基础培养基、ECGS和P/S按比例混合配制）。

2) 吸出未凝固的纤连蛋白溶液，T-75中加入20 mL的完全培养基，将解冻后的细胞小心加入到培养基中，十字交叉法轻柔平晃培养瓶。（注：不建议在解冻后对细胞进行稀释和离心，因为这些与培养物中残留DMSO的作用相比，这些作用对细胞的损伤更大；将HDLEC置于纤连蛋白包被的培养瓶中，促进生长同样重要。）

换液：培养开始后16小时内不要干扰培养。次日更换培养液，去除残留的DMSO和未贴壁细胞。之后每三天更换一次培养基，直到培养达到大约70%的密度。一旦培养达到大约70%的密度，每隔一天更换一次培养基，直到培养达到大约90%的密度。

传代：当细胞密度达到90%时进行传代。

1) 将T/E、包被培养瓶、DPBS、培养基提前置于室温平衡（不建议37℃加热）。

2) 弃除旧培养基，并用DPBS清洗细胞后吸除加入8 mL DPBS和2 mL 0.05% T/E solution 轻柔晃动培养瓶后放入37℃培养箱（注：原代细胞传代时请勿使用未稀释的胰蛋白酶），一段时间后镜下观察，待细胞完全变圆、脱落，轻轻拍打底部和侧面，加入2 mL FBS，将细胞悬液转移至15 mL离心管中，1000 rpm离心5 min，用新培养基重悬细胞沉淀后计数，根据5000-7000 cells/cm²的密度传代至预先用纤连蛋白包被的培养瓶中。

生长条件：在CO₂浓度为5%，温度为37℃，相对湿度（RH）为95%的细胞培养箱中培养。

表 1 HDLEC培养材料

参考文献

[1] Swartz A, Skobe M. (2001) “Lymphatic function, lymphangiogenesis, and cancer metastasis.” Microsc Res Tech. 55:92-9.

[2] Leak LV. (1970) “Electron microscopic observations on lymphatic capillaries and the structural components of the connective tissue-lymph interface.” Microvasc Res. 2: 361-91.

[3] Podgrabinska S, Braun P, Velasco P, Kloos B, Pepper M, Jackson D, Skobe M. (2002) “Molecular characterization of lymphatic endothelial cells.” PNAS. 99: 16069-74.

[4] Ji RC. (2006) “Lymphatic endothelial cells, tumor lymphangiogenesis and metastasis: New insights into intratumoral and peritumoral lymphatics.” Cancer Metastasis Rev. 25: 677-94.

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