【ScienCell】人纤维环细胞（HAFC）产品使用攻略
人纤维环细胞培养不成功、实验做不出来怎么办？新手小白迫切求助，希望各位前辈在文章下方留言，分享自己的经验，为小白们答疑解惑！
人纤维环细胞
（HAFC）
腰痛的原因包括遗传因素、环境因素和心理社会因素，而椎间盘退变是与腰痛有关的主要病理过程。纤维环构成了椎间盘结构的外围部分，由纤维软骨和I型及II型胶原组成。纤维环细胞受到白细胞介素-1β的刺激时，产生与局部降解和炎症过程有关的因子。尽管机械应力是退变的重要因素，但其潜在的分子机制尚不清楚。人纤维环细胞为研究椎间盘退变、组织工程和脊椎间盘疾病的细胞和分子事件提供了体外模型。HAFC分离自人椎间盘的纤维环，其fibronectin和vimentin特异性抗体免疫荧光染色呈阳性。
培养方式
培养瓶：PLL（多聚-L-赖氨酸）包被培养瓶。
培养基：HAFC用提供的NPCM完全培养基（包含基础培养基、2% FBS、1% NPCGS和1% P/S）培养。
操作步骤：
1) 包被PLL（2 μg/cm2）培养瓶（T-75培养瓶）的准备：将10 mL无菌水加入到T-75培养瓶中，加入15 μL PLL原液，轻轻吹匀后将培养瓶放置在37°C的孵育箱中过夜（或至少1小时）。
2) 无菌水清洗包被PLL的T-75 2次，加入20 mL完全培养基，将解冻后的HAPC加入至包被的T-75中，十字交叉法轻柔摇晃培养瓶使细胞分布均匀，将培养瓶放入细胞培养箱中。（注：不建议在解冻后稀释和离心细胞，因为这些操作对细胞的伤害比培养中残留的二甲基亚砜（DMSO）的影响更大。同时，将细胞置于PLL涂层培养有助于促进细胞附着。）
换液：为了获得最佳结果，在培养开始后至少16小时内不要干扰培养。第二天更换培养基，以去除残留的二甲基亚砜和未附着的细胞，之后每隔三天更换一次培养基，直到培养达到约70%的密度，一旦培养达到约70%的密度，每隔一天更换一次培养基，直到培养达到约90%的密度。
传代：当细胞密度达到90%-95%时进行传代。
1) 将T/E、DPBS、培养基提前置于室温平衡（不建议37℃加热）。
2) 弃除旧培养基，并用DPBS清洗细胞后吸除，加入5 mL DPBS和5 mL 0.05% T/E solution 轻柔晃动培养瓶后放入37℃培养箱，一段时间后镜下观察，待细胞完全变圆、脱落，轻轻拍打底部和侧面，加入2 mL FBS（#0500）终止消化，将细胞悬液转移至15 mL离心管中，1000 rpm离心5 min，用新培养基重悬细胞沉淀后计数，根据5000 cells/cm2的密度传代至预先用PLL包被的培养瓶中。
生长条件：在CO2浓度为5%，温度为37℃，相对湿度（RH）为95%的细胞培养箱中培养。
表 1 HAFC培养材料
参考文献
[1] Pincus T, Burton AK, Vogel S, Field AP. (2002) “A systematic review of psychological factors as predictors of chronicity/disability in prospective cohorts of low back pain.” Spine. 27:109-120.
[2] Rannou F, Corvol MT, Hudry C, Anract P, Dumontier MF, Tsagris L, Revel M, Poiraudeau S. (2000) “Sensitivity of anulus fibrosus cells to interleukin 1 beta. Comparison with articular chondrocytes.” Spine. 25:17-23.
[3] Annunen S, Paassilta P, Lohiniva J, Perala M, Pihlajamaa T, Karppinen J, Tervonen O, Kroger H, Lahde S, Vanharanta H, Ryhanen L, Goring HH, Ott J, Prockop DJ, Ala-Kokko L. (1999) “An allele of COL9A2 associated with intervertebral disc disease.” Science. 285:409-412.
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