【ScienCell】人脐静脉内皮细胞（HUVEC）产品使用攻略
人脐静脉内皮细胞培养不成功、实验做不出来怎么办？新手小白迫切求助，希望各位前辈在文章下方留言，分享自己的经验，为小白们答疑解惑！
人脐静脉内皮细胞
（HUVEC）
血管内皮细胞对于维持血管内环境平衡起着重要作用。血管内皮细胞产生和分泌凝血和纤溶系统的激活剂和抑制剂，释放调节细胞增殖和控制血管壁张力的分子，并介导血小板的粘附和聚集。由于易于获取和纯度高，人脐静脉内皮细胞（HUVECs）是研究内皮细胞生理学、血管生成和药物发现的最受欢迎的内皮细胞。HUVECs具有“鹅卵石”形态，细胞生长为单层紧密相对的多边形大细胞，含有原位内皮细胞特征的细胞质包涵体（Weibel-Palade小体）以及大量的平滑肌肌动蛋白，vWF/Factor VIII和CD-31特异性抗体免疫荧光染色呈阳性，并具有摄取乙酰化低密度脂蛋白的能力。培养的HUVECs内皮细胞也含有与组织供者血型相适应的ABH抗原，但在培养的平滑肌细胞或成纤维细胞上未检测到这些抗原。
培养条件
培养瓶：纤连蛋白（Bovine Plasma Fibronectin, 2 µg/cm2）包被培养瓶。
培养基：HUVEC用提供的ECM完全培养基（包含基础培养基、1% ECGS、5%FBS、1% P/S）培养。
操作步骤：
1) 包被纤连蛋白（2 µg/cm2）培养瓶的准备（T-75培养瓶）：将10 mL无菌的Dulbecco's磷酸盐缓冲盐（DPBS）与150 µL纤连蛋白原液混匀后加入到T-75培养瓶中，将培养瓶放置在37°C的孵育箱中过夜（或至少2小时）。在铺细胞前将未凝固纤连蛋白溶液吸出（可重复使用2次），加入20 mL ECM完全培养基（基础培养基、FBS、ECGS和P/S按比例混合配制）。
2) 吸出未凝固的纤连蛋白溶液，T-75中加入20 mL的完全培养基，将解冻后的细胞小心加入到培养基中，十字交叉法轻柔平晃培养瓶。（注：不建议在解冻后对细胞进行稀释和离心，因为这些与培养物中残留DMSO的作用相比，这些作用对细胞的损伤更大；将HUVEC置于纤连蛋白包被的培养瓶可促进生长。）
换液：培养开始后16小时内不要干扰培养。次日更换培养液，去除残留的DMSO和未贴壁细胞。之后每三天更换一次培养基，直到培养达到大约70%的密度。一旦培养达到大约70%的密度，每隔一天更换一次培养基，直到培养达到大约90%的密度。
传代：当细胞密度达到90%时进行传代。
1) 将T/E、包被培养皿、DPBS、培养基提前置于室温平衡（不建议37℃加热）。
2) 弃除旧培养基，并用DPBS清洗细胞后吸除加入8 mL DPBS和2 mL 0.05% T/E solution 轻柔晃动培养瓶后放入37℃培养箱（注：原代细胞传代时请勿使用未稀释的胰蛋白酶），一段时间后镜下观察，待细胞完全变圆、脱落，轻轻拍打底部和侧面，加入2 mL FBS，将细胞悬液转移至15 mL离心管中，1000 rpm离心5 min，用新培养基重悬细胞沉淀后计数，根据5000-7000 cells/cm2的密度传代至预先用纤连蛋白包被的培养瓶中。
生长条件：在CO2浓度为5%，温度为37℃，相对湿度（RH）为95%的细胞培养箱中培养。
表 1 HUVEC培养材料
参考文献
[1] DeCicco-Skinner, K. L., et al. (2014). "Endothelial cell tube formation assay for the in vitro study of angiogenesis." J Vis Exp(91): e51312.
[2] Ganguly, A., et al. (2012). "Isolation of human umbilical vein endothelial cells and their use in the study of neutrophil transmigration under flow conditions." J Vis Exp(66): e4032.
[3] Morgan DMLML. (1996) “Isolation and culture of human umbilical vein endothelial cells.” In Jones GE, Human Cell Culture Protocols (pp 104-109) Totowa: Humana Press.
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