【ScienCell】中耳上皮细胞（HMEEpiC）产品使用攻略

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人原代细胞 Human Primary cells 听觉细胞系统 Auditory Cell System Sciencell 中耳上皮细胞 Middle Ear Epithelial Cells Epithelial Cell Medium 4121

小白求助前辈指路

中耳上皮细胞培养不成功、实验做不出来怎么办？新手小白迫切求助，希望各位前辈在文章下方留言，分享自己的经验，为小白们答疑解惑！

中耳上皮细胞

（HMEEpiC）

中耳由三个听觉骨骼（镫骨、锤骨和砧骨）、鼓膜和咽鼓管组成。中耳的功能是将声能从鼓膜传递到耳蜗。中耳上皮细胞（MEEpiC）在中耳的稳态和无菌性中起着重要作用。与MEEpiC相关的异常可能导致中耳疾病的发展，如中耳炎和鼓室胆脂瘤。研究表明，上皮细胞增殖是鼓室胆脂瘤的潜在原因，且异常的上皮细胞增殖可能与中耳成纤维细胞产生的炎性因子有关。HMEEpiC可应用于中耳疾病的体外研究，用于鉴定中耳炎和鼓室胆脂瘤的新治疗靶点。HMEEpiC分离自人中耳组织，可通过cytokeratin-18和cytokeratin-19特异性抗体免疫荧光染色进行鉴定。

培养方式

培养瓶：纤连蛋白（Bovine Plasma Fibronectin, 2 µg/cm²）包被培养瓶。

培养基：HMEEpiC在提供的EpiCM-2完全培养基（包含基础培养基、1% EpiCGS-2和1% P/S）中培养。

操作步骤

1) 包被PLL（2 μg/cm²）培养瓶（T-75培养瓶）的准备：将10 mL无菌水加入到T-75培养瓶中，加入15 μL PLL原液，轻轻吹匀后将培养瓶放置在37°C的孵育箱中过夜（或至少1小时）。

2) 无菌水清洗包被PLL的T-75 2次，加入20 mL EpiCM-2完全培养基（基础培养基、EpiCGS-2和P/S按比例混合配制），将解冻后的HMEEpiC加入至包被的T-75中，十字交叉法轻柔摇晃培养瓶使细胞分布均匀，将培养瓶放入细胞培养箱中。（注：不建议在解冻后稀释和离心细胞，因为这些操作对细胞的伤害比培养中残留的二甲基亚砜（DMSO）的影响更大。同时，细胞在PLL包被培养瓶中有助于促进细胞附着。）

换液：为了获得最佳结果，在培养开始后至少16小时内不要干扰培养。第二天更换培养基，以去除残留的二甲基亚砜和未附着的细胞，之后每隔三天更换一次培养基，直到培养达到约70%的密度，一旦培养达到约70%的密度，每隔一天更换一次培养基，直到培养达到约90%的密度。

传代：当细胞密度达到90-95%时进行传代。

1) 将T/E、包被培养瓶、DPBS、培养基提前置于室温平衡（不建议37℃加热）。

2) 弃除旧培养基，并用DPBS清洗细胞后吸除加入10 mL 0.05% T/E solution 轻柔晃动培养瓶后放入37℃培养箱（注：原代细胞传代时请勿使用未稀释的胰蛋白酶），一段时间后镜下观察，待细胞完全变圆、脱落，轻轻拍打底部和侧面，加入5 mL FBS，将细胞悬液转移至50 mL离心管中，1000 rpm离心5 min，用新培养基重悬细胞沉淀后计数，根据5000 cells/cm²的密度传代至预先用Bovine Plasma Fibronectin包被的培养皿中。

生长条件

在CO₂浓度为5%，温度为37℃，相对湿度（RH）为95%的细胞培养箱中培养。

表 1 HMEEpiC培养材料

参考文献

[1] Mulay A, Akram K, Williams D, Armes H, Russell C, Hood D, Armstrong S, Stewart J, Brown S, Bingle L, Bingle C. (2016) “An in vitro model of murine middle ear epithelium.” Dis Model Mech. 9: 1405-1417.

[2] Straetemans M, van Heerbeek N, Tonnaer E, Ingels K, Rijkers G, Zielhuis G. (2001) “A comprehensive model for the aetiology of otitis media with effusion.” Med Hypotheses. 57: 784-791.

[3] Xie S, Xiang Y, Wang X, Ren H, Yin T, Ren J, Liu W. (2016) “Acquired cholesteatoma epithelial hyperproliferation: Roles of cell proliferation signal pathways” Laryngoscope 126(8): 1923-1930.

[4] Yoshikawa, M, Kojima H, Yaguchi Y, Okada N, Saito H, Moriyama H. (2013) “Cholesteatoma fibroblasts promote epithelial cell proliferation through overexpression of epiregulin.” PLoS One. 8(6): e66725.

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