【Promega】降解表型

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promega N3030 N3040 N3050 N2420 N2421 N2422 N2410 N2011 N2012 N2013 N2580 N2581 N2582 N2570 N2571 N2572 N2681 N2627 CS1956D07 CS1956D05 GA3110 GA4110 N1581 CS1956B17 CS3023278 CS3023277 GA1110 GA1111 GA1120 GA1121

在开发 PROTAC 前，通常需要确定合适的靶点，将其敲除后，可获得目标表型。HaloPROTAC3 可通过介导HaloTag®（HT）融合蛋白的靶向降解来轻松实现对降解表型的评价。

▍▏检测工作流程

▍▏确认靶蛋白降解是 PROTAC 介导的 VHL 参与的机制

对映体化合物ent-HaloPROTAC3 可与 HaloPROTAC3 配合使用，其可用于确认 HaloTag® 融合蛋白的确是通过 VHL 参与的 PROTAC 机制被降解。ent-HaloPROTAC3 与其对映体分子量相同，且基本结构也相同。

然而，D- 羟脯氨酸（D-Hyp）和 D-缬氨酸（D-Val）残基修饰可对其与VHL 的结合造成显著影响（图 A）。

以 CRISPR 编辑 HEK293 细胞，使细胞共表达 HiBiT- HaloTag® -BRD4融合蛋白及 LgBiT 亚基。使用不同浓度的 HaloPROTAC3 变体处理细胞。同时对重组 BRD4 的蛋白浓度水平进行了实时监测。HaloPRTOAC3 处理产生了与浓度相关的靶蛋白损失，但ent-HaloPROTAC3 处理组，却未检测到蛋白降解（图 B）。

▍▏Wnt/β-Catenin 模型系统

β-Catenin(β- 连环蛋白 ) 是经典的 Wnt 信号通路的重要组成物质。通过该临床相关通路，细胞可整合外部信号，实现对胚胎发育的全面控制。在非刺激条件下，β- 连环蛋白与 β- 连环蛋白破坏复合物发生结合，并发生磷酸化。这可使 E3 连接酶 β-TrCP发生聚集，并导致 β- 连环蛋白发生多聚泛素化和蛋白酶体降解。Wnt 配体与膜受体 Frizzled 发生结合时可激活了这一信号通路，进而促进 β- 连环蛋白的胞质聚集，并随后促进其发生核转位。此时作为转录共激活因子，β- 连环蛋白通过与 T 细胞因子 / 淋巴增强因子（TCF/LEF）转录因子发生结合，启动Wnt 应答基因的转录。

▍▏靶蛋白丢失与表型之间的联系

转录共激活因子 β- 连环蛋白是 Wnt 信号通路的关键组成物质，使用 HiBiT-HaloTag® 对其进行内源性标记。（图 A）使用 HaloPROTAC3 进行处理后，所获结果证实了靶蛋白降解与时间和剂量的相关性。（图 B）利用含 TCF 响应元件（RE）的萤火虫萤光素酶基因报告质粒，检测 HaloPROTAC3 处理导致的对 mWnt3a 诱导的 β- 连环蛋白 /TCF 介导的转录的抑制作用。

▍▏产品包装内容

HaloPROTAC3

ent-HaloPROTAC3 (Negative Control)

HiBiT-HaloTag® CRISPR Donor Vector (N-terminal)

HaloTag®-VS-HiBiT CRISPR Donor Vector (C-terminal)

HaloTag® CRISPR Donor Vector (N-terminal)

HaloTag® CRISPR Donor Vector (C-terminal)

Janelia Fluor® 549 HaloTag® Ligand

Janelia Fluor® 646 HaloTag® Ligand

LgBiT Expression Vector

检测试剂

• Nano-Glo® HiBiT Lytic Detection System