【Promega】靶蛋白降解
靶蛋白降解概述
蛋白质降解是维持细胞蛋白质内稳态的重要机制。当无功能蛋白的溶酶体和 / 或蛋白酶体清除途径失效时，会形成聚合物，而这些聚合物可导致机体内潜发各种疾病，包括帕金森病和阿尔茨海默病。
另一方面，通过影响细胞降解机制进而使靶蛋白发生明显降解，可作为一种治疗癌症、自身免疫和神经疾病等疾病新型治疗方法，拥有巨大的应用前景。相较于传统的小分子疗法，蛋白降解药物具有多种优势，例如其可扩大“可靶向”蛋白质组的使用范围，延长药代动力学持续时间；同时蛋白降解药物以催化的模式起作用，因此使用其进行治疗时，给予较低给药剂量即可达到较好效果。分子胶和蛋白降解靶向嵌合体（PROTAC）是该类新型小分子降解药物（如LYTAC、PHOTAC、PROTAC、分子胶、AUTAC、疏水标记物）中最具有代表性的药物。
▍▏PROTAC 结构和作用机制
PROTAC 属于异源双功能分子，其由两个配体结构域组成，而两个配体结构域则通过长度不同的连接体偶联而成。一个配体可与靶蛋白（T）结合，而另一个配体则结合 E3 泛素连接酶复合物（图 A）。PROTAC 的作用机制为其可将靶蛋白（T）与 E2/E3 连接酶复合物进行连接。PROTAC 可拉近靶蛋白与 E3 连接酶间的距离，从而促进靶蛋白的泛素化和蛋白酶体降解，而同时 PROTAC 还可循环发挥作用（图 B）。
▍▏有关 PROTAC 开发的基本问题
靶蛋白降解
使用 PROTAC 的主要目标为对某一特定靶蛋白进行降解。过去，业内广泛采用免疫检测和质谱分析对靶蛋白丢失进行相关验证。虽然这些方法可实现对内源性蛋白质的检测，但其操作过程均较为复杂、繁琐。此外，这些方法均为裂解法终点检测，因而其无法获取蛋白质的多相降解相关特征信息。虽然使用自发荧光蛋白进行标记可实时监测靶点丢失，但因其分子量较高，所以在基因组进行靶向插入较为困难，且其效率也会受到较大影响。然而，经相关研究证明，受基因自身启动子控制的内源性表达是获取相关生理降解数据的必要因素。生物发光肽标签 HiBiT（“High BiT”）可满足前述所有要求。HiBiT 是一种由 NanoLuc® 萤光素酶衍生的 11 个氨基酸肽亚基，其可与互补的 LgBiT（“LargeBiT”）亚基高亲和力地进行结合（KD = 700 pM），因而可实现对其的检测。这些亚基结合在一起后即可重新形成功能性 NanoBiT® 萤光素酶，可通过生物发光法实现对其的轻松检测。因此，可通过使用 LgBiT 和萤光素酶底物furimazine 对 HiBiT 标记的蛋白质进行定量检测。
▍▏检测工作流程
通过 CRISPR/Cas9 技术，可将 HiBiT 编码序列插入至目标基因位点中（图 1）。加入 PROTAC 后，重组 HiBiT 融合蛋白的降解 / 恢复可以用裂解法终点检测或活细胞实时动力学检测来确定（图 2）。
▍▏制备内源性标记 HiBiT 标签融合蛋白的途径
您可以自己 DIY 无需克隆的基因编辑操作，也可以从我们不断更新的即用型 CRISPR 编辑细胞库中直接选择需要的细胞以最大程度提高操作便利性！
▍▏PROTAC 处理后蛋白降解的实时定量
在稳定表达 LgBiT 亚基的细胞中，使用 HiBiT 对 BET 家族成员 BRD4 进行 CRISPR 介导的蛋白标记，可实时监测靶向的内源性蛋白的降解情况。在零时加入 PROTAC dBET6（图 A）和 dBET1（图 B）前，用增强型 Nano-Glo®EndurazineTM 活细胞底物对细胞进行预平衡。记录 24 小时内的发光信号，并确定 HiBiT-BRD4 降解率和回收率。
▍▏根据实时降解曲线计算定量参数
记录实时蛋白降解率和回收率，可确定定量降解参数，即降解百分比、半数降解浓度（DC50）、最大降解水平（Dmax）（图 A）和降解速率（图 B）。这些定量降解参数可用于对化合物进行排序。在较高 dBET6 浓度下，因三元复合物（靶蛋白：PROTAC：E3 连接酶）形成受阻而导致降解率发生降低，该现象也称为“钩状效应”。
▍▏产品包装内容
LgBiT 稳转细胞系
• HEK293
• Jurkat
• HeLa
LgBiT 表达载体
即用型 CRISPR/HiBiT 细胞系
检测试剂
• Nano-Glo® HiBiT Lytic Detection System
• Nano-Glo® HiBiT Extracellular Detection System
• Nano-Glo® HiBiT Blotting System
• Nano-Glo® Live-Cell Assay System (0 – 2 h)
• Nano-Glo® Vivazine™ Substrate (2 – 24 h)
• Nano-Glo® Endurazine™ Substrate (2 – 72 h)
▍▏相关产品列表
Nano-Glo® HiBiT 检测试剂
细胞内 LgBiT 亚基的表达
HaloTag® HiBiT 融合蛋白的降解
点在看，传递你的品味
