【Promega】核苷酸和辅因子检测

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NAD+, NADP+, NADH 和 NADPH 是参与细胞内关键信号通路的多种酶类的重要辅因子 , 这种二核苷酸的定量是确定多种酶类活性的标准方法，无论是直接或者通过偶联到其他 NADH- 或 NADPH-产生的反应。而 ATP 是细胞健康的关键指标，与许多代谢网络相关。Promega 提供多种系统检测和定量这些重要的分子。

二核苷酸检测

NAD+、NADH、NADP+ 和 NADPH

癌症是一种细胞生长失控的疾病，需要癌症细胞改变代谢途径才能生存和增殖。致癌基因和抑癌基因的这种代谢重编程的主要机制仍不清楚。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+、NADH、NADP+ 和 NADPH）是细胞能量代谢的基本共同因素。这些二核苷酸对大分子生物合成和维持细胞氧化还原电位至关重要。此外，NAD 依赖的信号通路（例如，单 ADP 和多 ADP 核糖基化、蛋白质脱乙酰化）参与调节与癌症发展相关的其他过程，包括表观遗传调节、细胞周期进展、DNA修复和昼夜节律。NAD+、NADH、NADP+ 和 NADPH在细胞能量代谢和信号传导中的中心作用使它们成为连接细胞代谢状态与能量稳态和基因调节的重要靶点独立节点。快速、易用的测定这些二核苷酸的方法为研究它们在这些过程中的作用提供了方便的工具。

Promega 提供了三种生物发光测定法，用于快速、灵敏地检测氧化还原定义的辅因子 NAD+、NADH、NADP+ 和 NADPH。

■生物发光法优于其他检测方法

上图：生物发光是检测烟酰胺腺嘌呤二核苷酸最灵敏的方法，将该检测方法与其他检测方法进行比较。

■对 NAD(P)⁺ 和 NAD(P)H 检测具有选择性

上图：NAD/NADH-Glo™ 和 NADP/NADPH-Glo™ 检测对磷酸化或非磷酸化形式的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸具有选择性。

NAD/NADH,NADP/NADPH 检测

NAD/NADH-Glo™ | NADP/NADPH-Glo™ Assays

NAD/NADH-GIo™ Assay和NADP/NADPH-GIo™ Assay 是基于发光的一步法、均质检测方法。能够快速检测细胞和酶促反应中的 NAD⁺和 NADH 以及 NADP⁺和 NADPH 水平。该方法可用于检测多孔板中的单个核苷酸或用于低活性或低 Km 值酶的分析,也更适用于高通量形式的抑制剂筛选。

■检测原理

NAD(P)循环酶用于将NAD(P)转换为 NAD(P)H。在NAD(P)H 存在时，还原酶将 proluciferin(还原酶底物)还原成萤光素。萤光素通过 Ultra-Glo™ 重组萤光素酶定量，反应产生的光信号与样品中的 NAD(P) 和 NAD(P)H 的量成正比。

■应用

• 监测细胞内总NAD(P)⁺ 和NAD(P)H 水平的变化；

• 确定 NAD(P)⁺/NAD(P)H 比值；

• 监测小分子化合物对酶促反应中NAD(P)⁺ 和NAD(P)H 水平的影响或以高通量形式直接在细胞中的影响。

■样本类型

细胞或者纯酶

■产品特点

△灵敏度高：对细胞数量要求更少，无需样品制备可直接检测细胞孔中NAD(P) /NAD(P)H 含量。

△一步法：加样- 混合 -检测的均质检测

△线性范围宽：1nM ~500nM。

△信噪比 (S/B max) :~250

△高通量检测：操作方案兼容自动化和高通量检测, 支持96、384 和1536 孔板检测。

△可靠：具有良好的可重复性 , 实验中的 Z' 因子值 >0.7。

△不受干扰：基于发光法检测，避免了荧光检测方法中常见的试剂和待测化合物的荧光干扰。

■操作步骤

■应用：检测多种样本中NAD/NADH,NADP/NADPH

检测类器官样本中的NAD/NADH和 NADP/NADPH

将 HCT116 细胞(RPMI+10%FBS)接种在 InSphere 的 GravityPLUS™ 96 孔板悬滴平台中培养4天。

加入等体积的 CellTiter-Glo 3D 试剂，振荡5分钟，30 分钟后记录发光信号。

从微组织中去除培养基，并在检测前用 50u PBS 代替。对于 NAD/NADH-GIo™ 和 NADPINADPH GIo™ 通过加入 50ml 碳酸氢盐缓冲液(pH 10.5，+2%DTAB)并振荡 30 分钟，来裂解直径逐渐递增的细胞微球体。裂解后，将样品分成 50ml 等分试样用于选择性二核苷酸降解。向一份等分试样中加入酸(25m1 0.4N HCI)，然后两份等份试样都在 65℃℃下加热，然后用 25μl 0.5MTrizma(酸处理)或 50μl 0.2N HCl/0.25M Trizm(碱处理)中和。将中和过的样品等分，分别与 50μl NAD/NADH-GIo™ 或NADP/NADPH GIo™检测试剂一起孵育。在 60 分钟时记录发光。

■检测细胞样本中的胞内 NADP+/NADPH( 图 A)NAD⁺/NADH( 图 B)。

■检测生化样本中的NADP⁺/NADPH，NAD⁺/NADH。

按照说明书检测每种纯化的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸。

NADH、NADPH、NAD⁺和 NADP⁺储存液以粉末(SigmaCat.#N6660、N9910、N8285 和 N8035)新鲜制备，并在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中稀释至指定浓度。在白色 96 孔板中每种二核苷酸浓度的 50ml样品与 50u NAD/NADH-GIo^™Detection Reagent 试剂共孵育。

NADH、NADPH 检测

NAD(P)H-Glo™ Detection System

NAD(P)H-Glo™ Detection 是基于发光的一步法、均质检测方法。能够快速检测细胞和酶促反应中的 NADH 和 NADPH 的浓度，NAD⁺和 NADP⁺( 氧化形式 )不会被该试剂盒检测到，也不会干扰定量。该检测系统具有很宽的线性范围和高信噪比，非常适合高通量测定 NAD(P)H的产生或消耗。

■检测原理

在 NAD(P)H 存在的情况下，还原酶还原 proluciferin 还原酶底物以形成萤光素。然后使用 Ultra-Glom 重组萤光素酶定量萤光素，产生的光信号与样品中 NAD(P)H 的量成比例。还原酶和萤光素酶反应是通过将等体积的单一试剂转移至含 NAD(P)H 的样品开始的，该试剂包含还原酶、proluciferin 还原酶底物和 Ultra-Glo™ 重组萤光素酶。