【Promega】HiBiT 蛋白标签系统介绍

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promega N3030 N3040 N3050 N2420 N2421 N2422 N2410 N3010 N2011 N2012 N2013 N2580 N2581 N2582 N2570 N2571 N2572 N2590 N2681 N2672 N2361 N2371 N2381 N2401 N2391 N2411 GA1050 GA1040 GA2550 GA1110 GA1111 GA1120 GA1121 N7200 N7210

HiBiIT 蛋白标签系统

将生物发光应用于蛋白分析

使用 HiBIT 蛋白标签系统，可开发出操作简便、灵敏度高的蛋白定量方法，来检测蛋白丰度或定位的变化。HiBiT 系统简化了活细胞中的蛋白标签，提供了一种精简、无抗体检测方案，仅需使用光度计进行信号定量。HiBiT 技术凭借其测定内源性表达水平灵敏度高和仅需加入单一试剂的便利，为蛋白生物学研究人员开辟了无限可能。

原理

HiBiT 是一个由 11 个氨基酸构成的肽标签，可以连接到任何目的蛋白(POI)，可在10分钟或更短时间内使用生物发光试剂进行检测。检测试剂含有一个无活性的萤光素酶亚基 LgBiT，其能快速与 HiBIT结合,产生一种高活性萤光素酶,

用于内源性生物学的高灵敏蛋白定量技术

较宽的线性动态范围可准确定量 HiBiT 标签蛋白，不受蛋白表达水平的影响。HiBiT 检测系统的检测限<10-19摩尔，支持在内源性表达水平对低丰度蛋白进行定量。

【参考文献】

1.Schwinn, M.k. et al. (2020) A simple and scalable strategy for analysis of endogenous protein dynamics. PSc Rep. 10(1):8953

2.Boursier, M.E. et a. (2020) The luminescent HiBiT peptide enables selective quantitation of G protein-coupled ligandenaagementand internalization in livina cells.y, Biol. Chem. 295(15):5124-5135

3.Riching, K.M. et al. (2018) Quantitative Live-Cell Kinetic Degradation and Mechanistic Profiling of PROTAC Mode of Action.ACS Chem Biol.13(9):2758-2770

4.Sasaki, M. et a/. (2018) Development of a rapid and quantitative method for the analysis of viral entry and release using a NanoLuc luciferase complementation assay. Virus Res. 243:69-79

5.Schwinn, M.k. et a. (2018): CRlSPR-Mediated Tagging of Endogenous Proteins with a Luminescent Peptide AcS chem Bio.13(2):467-474

6.Oh-Hashi, K. ef al. (2017) Application of a novel HiBiT peptide tag for monitoring ATF4 protein expression in Neuro2a cells Biochem Biophys Rep.12:40-45

7.Rouault, A. A. J. et al. (2017) Regions of MRAP2 reguired for the inhibition of orexin and prokineticin receptor signaling Biochim Biophys Acta.1864:2322-2329

HiBiT 标签与定量工作流程

HiBiT 标签蛋白的定量：HiBiT 标签蛋白定量仅需“加入 - 读数”测定，无需抗体，操作简单。（A）通过 LgBiT亚基的瞬时或稳定共表达与其中一种非裂解性 Nano-Glo® 底物，实时动力学研究可达 72 小时。（B）裂解检测试剂定量 HiBiT 标签蛋白的总量，而细胞外检测试剂检测细胞表面或分泌型的标签蛋白的量。（C）通过使用 HiBiT 印迹试剂，在常规蛋白免疫印迹分析膜上快速测定 HiBiT 标签蛋白的大小。

通过内参报告基因归一化来控制特异性

HiBiT NanoDLR™

Nano-Glo®HiBiT 双萤光素酶®报告基因检测系统可以在同一孔中对 HiBiT 标签蛋白和萤火虫萤光素酶(Fluc)进行多重检测。该检测系统可最大程度减少或消除由转染效率、细胞数量、细胞活性、温度或检测时间等因素导致的实验变异性，从而提高数据质量。检测 HiBiT目的蛋白(POI)的调控降解时，该方法可以区分蛋白表达水平总体变化导致的特异性效应。

POI的编码序列(coding sequence ofthe POl, GOl)克隆到一个带有N端或C端 HiBiT 标签的多克隆位点(MCS)。HiBIT 融合蛋白的终止密码子之后是一个IRES序列，该序列能够使来自相同 mRNA的非融合 Fluc进行组成性共表达第一步(1)，加入含有 LgBiT 蛋白的 ONE-GIo™ EX 试剂，定量 Fluc。其可裂解细胞，提供 Fluc 底物，并将 HiBi7标签转换为 NanoBiT®萤光素酶。第二步(2)，向样品中加入NanoDLR® Stop&Glo®Reagent，淬灭 Fluc 信号并提供 NanoBiT® Substrate。

用 TK启动子驱动的 HiBiT-BRD4和 Fluc 的双顺反子表达构建体瞬时转染 HEK293 细胞。(A)用靶向 BRD4的PROTAC 化合物 dBET1 处理细胞，会导致 HiBiT-BRD4 特异性降解，而 Fluc对照不会发生降解。(B)另一方面用有毒化合物星形孢菌素处理，两种蛋白信号均出现了非特异性下降。

特点和优势

标签小(11 个氨基酸，1.3kDa)

●降低对融合蛋白伴侣功能的潜在影响

●大大简化了 CRISPR/Cas9 基因组敲入的工作流程

便于用 CRISPR/Cas9 进行内源性蛋白检测

●研究内源性调控下的蛋白质

●无需克隆

●方案可优化

简单、快速的检测方案

●一步均质检测(“加入-读数”)

●无需抗体，无洗涤步骤

●适用于高通量筛选

多种检测模式

●裂解终点法检测模式

●活细胞形式(细胞内和细胞外)，具有可延长时程分析选项

灵敏度及定量

●Sub-attomole 级灵敏度，能够检测内源性水平的蛋白

●线性检测范围大(>7 logs）

产品列表

Product	Size	Cat. #
Nano-Glo®HiBiT 裂解检测系统	10 ml	N3030
	100 ml	N3040
	10x100 ml	N3050
Nano-Glo®HiBiT 细胞外检测系统	10 ml	N2420
	100 ml	N2421
	10x100 ml	N2422
Nano-Glo® HiBiT 印迹系统	100 ml	N2410
HiBiT 对照蛋白	100 µl	N3010

Product	Size	Cat. #
Nano-Glo® 活细胞测定系统	100 assays	N2011
	1000 assays	N2012
	10,000 assays	N2013
Nano-Glo® Vivazine™ 底物	0.1 ml	N2580
	1 ml	N2581
	10 ml	N2582
Nano-Glo® Endurazine™ 底物	0.1 ml	N2570
	1 ml	N2571
	10 ml	N2572
Nano-Glo® 扩展的活细胞底物试验包	0.2 ml	N2590
LgBiT 亚基的共表达
LgBiT Expression Vector [CMV / Hygro]	20 μg	N2681
LgBiT-LentiB3 Transfer Vector	20 μg	Please Enquire
HaloTag®-LgBiT Expression Vector [CMV / Hygro]	20 μg	Please Enquire
HEK293 LgBiT Cell Line (stable)	1 each	N2672
HeLa LgBiT Cell Line (stable)	2 vials	Please Enquire
Jurkat LgBiT Cell Line (stable)	2 vials	Please Enquire

Product	Size	Cat. #
HiBiT NanoDLR™
Nano-Glo® HiBiT Dual-Luciferase™ Reporter System	10ml	Please Enquire
Nano-Glo® HiBiT Dual-Luciferase™ Reporter System	100ml	Please Enquire
pBiT4.1-C [HiBiT-IRES-luc2/CMV/Blast] Vector	20 μg	Please Enquire
pBit4.2-C [HiBiT-IRES-luc2/TK/Blastl Vector	20 μg	Please Enquire
pBiT4.3-C [HiBiT-RES-luc2/PGK/Blast] Vector	20 μg	Please Enquire
pBiT4.1-N [HiBiT-IRES-luc2/CMV/Blast] Vector	20 μg	Please Enquire
pBit4.2-N [HiBiT-IRES-luc2/TK/Blastl Vector	20 μg	Please Enquire
pBiT4.3-N [HiBiT-IRES-luc2/PGK/Blast] Vector	20 μg	Please Enquire
HiBiT 融合载体
pBiT3.1-N [CMV/HiBiT/Blastl Vector	20 μg	N2361
pBiT3.1-C[CMV/HiBiT/Blastl Vector	20 μg	N2371
pBiT3.1-secN [CMV/HiBiT/Blastl Vector	20 μg	N2381
pFN38K HiBiT CMV-neo Flexi Vector	20 μg	N2401
pFC37K HiBiT CMV-neo Flexi° Vector	20 μg	N2391
pFN39K secHiBiT CMV-neo Flexi Vector	20 μg	N2411
自噬 LC3 HiBiT 报告基因检测系统
U2OS Autophagy LC3 HiBiT Reporter Cell Lineand Detection System	1 kit*	GA1050
HEK293 Autophagy LC3 HiBiT Reporter Cell Lineand Detection System	1 kit*	GA1040
Autophagy LC3 HiBiT Reporter Vector and Detection System	1 kit*	GA2550
Janelia Fluor 549 HaloTag Ligands	5ug	GA1110
Janelia Fluor 549 HaloTag Ligands	3x5ug	GA1111
Janelia Fluor 646 HaloTag Ligands	5ug	GA1120
Janelia Fluor 646 HaloTag Ligands	3x5ug	GA1121
* 包括 10mL Nano-Glo® HiBiT 裂解检测系统

Product	Size
HiBiT 靶细胞杀伤作用检测
LgBiT Protein	10ml
LgBiT Protein	0.1ml
HaloTag"-HiBiT Vector [CAG / Blast]	2μg
HaloTag®-HiBiT Target Cells
Raji Cells, Propagation Model	2 vials
Ramos Cells, Propagation Model	2 vials
A549 Cells, Propagation Model	2 vials
H929 Cells, Propagation Model	2 vials
SK-BR-3 Cells, Propagation Model	1 vial
K562 Cells, Propagation Model	1 vial
U937 Cells, Propagation Model	1 vial
LDH-HiBiT Target Cells
Raji Cells, Propagation Model	2 vials
Raji CD19-KO Cells, Propagation Model	2 vials
Ramos Cells, Propagation Model	2 vials
Ramos CD19-KO Cells, Propagation Model	2 vials
OVCAR-3 Cells, Propagation Model	2 vials
SC-0V-3 Cells, Propagation Model	2 vials
A549 Cells, Propagation Model	2 vials
T2 Cells, Propagation Model	2 vials
PBMC ADCC Bioassays
PBMC ADCC Bioassay Kit (Raji)	1 kit*
PBMC ADCC Bioassay Kit (Ramos)	1 kit*
PBMC ADCC Bioassay Kit (A549)	1 kit*
PBMC ADCC Bioassay Kit (H929)	1 kit*
PBMC ADCC Bioassay Kit (SK-BR-3)	1 kit*
*包括细胞培养基、胎牛血清（FBS）和 10mL Nano-Glo® HiBiT 细胞外检测系统。