【Promega】HiBiT 蛋白标签系统应用

利用 HiBiT 蛋白标签系统，研究人员在功能基因和蛋白分析领域拥有了无限可能。该系统可用于构建新的检测方法，通过生物发光蛋白标签探究细胞蛋白生物学。通过对检测方案进行优化，以及使用多种检测试剂，可对单一靶蛋白建立以细胞为基础的检测方法。

检测调控蛋白表达、蛋白稳定性、靶向蛋白降解、受体内化、靶细胞杀伤……

HiBiT标签技术可以轻松应用于监测翻译后的调控过程，如下图泛素介导的转录因子HiF1α降解。本实验使用NanoGlo® HiBiT Lytic Detection System来检测蛋白丰度的调控变化。

▍▏转录因子 HIF1α 的稳定性

组成型表达转录因子 HIF1α 的水平通过分子氧(O,)的存在控制。在常氧条件下，HIF1a与脯氨酰羟化酶发生氧依赖性反应的脯氨酰羟化。该修饰导致肿瘤抑制因子Von-Hippel-Lindau (VHL)和 E3 泛素连接酶复合体其他组分的募集，标志着 HIF1a 通过多泛素化进行蛋白酶体降解。缺氧条件下或用菲咯啉化学抑制脯氨酰羟化酶后，HIF1α 蓄积，与 B- 亚基形成二聚体，并促进 HIF1a 应答基因表达。通过用 HiBiT 标签标记 HIF1a，可以轻松检测这种翻译后调控过程，

▍▏不同表达水平下缺氧诱导的 HIF1α 稳定性定量

使用 Nano-Glo® HiBiT Blotting System，可在不使用抗体的情况下快速观察经菲咯啉处理的细胞的 HIF1α 稳定情况。用 PGK启动子驱动的 HiF1a-HiBiT 表达构建体瞬时转染细胞，对细胞裂解物进行印迹分析，

HiBiT 标签小，有利于其插入到病毒基因组中，而与 LgBiT 互补则可以进行活细胞病毒进入与复制检测。相较于ELISA 等传统的检测方法，HiBiT 提供了操作简单、可兼容 HTS“加入 - 读取”检测形式，不需要抗体或洗涤步骤。

▍▏利用HiBiT 蛋白标签系统分析病毒进入与释放

使用 Nano-Glo®活细胞检测系统 (Nano-Glo®Live Cell Assay System)，可以在表达与 HiBiT 互补的 LgBiT 亚基的活细胞中监测带有 HiBiT 标签的病毒样颗粒(VLP)的细胞感染(左)。此外，通过向 Nano-Glo®HiBiT Lytic DetectionSystem 中加入含亚病毒颗粒(SVP)的上清液，可以很简便地定量检测 SVP 的释放(右)。

自噬是细胞内降解多余或有害亚细胞物质的重要途径，因此在正常和应激条件下对维持细胞健康至关重要。LC3 蛋白总水平的变化可用于监测自噬潮的变化。HiBiT 技术应用于构建自噬 LC3 HiBiT 报告基因检测系统 (Autophagy LC3 HiBiT Reporter Assay System)，该系统提供一种均质的基于生物发光技术的多孔板模式的检测方法，用于定量评估自噬作用，包括简单可靠地区分通路的诱导剂和抑制剂。

▍▏自噬过程中 LC3 的降解过程

▍▏LC3 HiBiT 报告基因——两次检测合二为一

通过基因工程用 HiBiT 和 HaloTag®标记人类 LC3B 蛋白,建立了自噬 LC3 HiBiT 报告基因。通过基于裂解发光测定方法定量 LC3 HiBiT 报告基因的量。发光信号量与裂解液中报告基因的量呈正比，因此检测信号与自噬潮呈负相关。此外，明亮的 Janelia Fluor HaloTag Ligands 可对 LC3 报告基因定位变化进行荧光成像。

▍▏利用自噬 LC3 HiBiT 报告基因检测系统测定自噬潮

(A)用自噬诱导剂 PP242 处理稳定的 U2OS 自噬 LC3 HiBIT 报告基因细胞，由于 HiBiT 标记的自噬报告基因降解导致发光信号呈现时间和浓度依赖性衰减。(B)采用浓度递增的参比抑制剂 Baflomycin A1(BafA1)，在不加(溶剂)或加入 2uM PP242 的情况下处理报告基因细胞 21 小时。与 PP242 共处理显著延长了自噬抑制剂的检测窗口。

蛋白降解是改变信号通路活性的一种常见机制。除通过 RNA或化学抑制分子活性敲除某个蛋白外，通过蛋白水解靶向嵌合体(proteolysis-targeting chimeras，PROTACS)靶向降解蛋白已经成为一种很有前景的药物干预细胞信号的策略，尤其是在缺乏调控或活性位点与传统酶抑制剂结合的情况下的蛋白质。

▍▏PROTACS-靶向蛋白降解

PROTACs是双官能团分子，由与靶蛋白结合的部分和与E3连接酶复合体组分结合的部分偶联而成。各部分同时结合将 E3 连接酶复合体带至靶蛋白附近，导致其泛素化和后续蛋白酶体降解。PROTACs dBET1 和 dBET6 设计用于BET家族蛋白靶向蛋白降解，例如溴结构域蛋白4(bromodomain-containing protein 4，BRD4)。通过用 HiBiT 标签标记靶蛋白，可以很容易地监测该过程。

▍▏监测用 PROTAC dBET1 处理的细胞内 HiBiT-BRD4 的靶向降解

呈 dBET1 剂量依赖性的 HiBiT-BRD4 的降解程度受其表达水平的影响。过表达可能会掩盖内源性泛素连接酶和蛋白酶体的形成。通过减少转染 CMV 表达载体的量、使用较弱的 TK启动子或标记内源性表达的蛋白来降低表达水平，提高响应强度。蛋白降解动力学只能用内源性蛋白进行研究，因为调控天然蛋白与异位蛋白周转的机制影响降解速率、程度和恢复。

▍▏在384 孔板的 CRISPR 衍生的多克隆细胞株中诱导 HiBiT-BRD4 降解

Nano-Glo® HiBiT Lytic Detection System凭借其检测方案简单，发光信号半衰期大于3个小时，成为高通量应用中批量处理多块板的理想选择。相较于抗体检测方法HiBiT 灵敏度更高，操作更简单，因而更有利于蛋白降解HTS 的测定。

▍▏PROTAC处理后蛋白损失实时定量

在稳定表达 LgBiT 亚基的细胞中，使用 CRISPR 介导 HiBiT 对 BET 家族成员 BRD4 进行蛋白标记，能够实时监测靶向内源性蛋白降解。在零时，加入PROTACS dBET6(A)和 dBET1(B)前，用长时间型 Nano-Gl®Endurazine™Live-Cell Substrate 预平衡细胞。记录 24 小时内的发光信号，确定 HiBiT-BRD4 降解和恢复。

▍▏根据实时降解曲线计算定量参数

记录实时蛋白降解率和恢复,可以确定定量降解参数,即降解百分比、半最大降解浓度(DC₅₀)、最大降解水平(D_max)(A)和降解率(B)。这些参数可用于化合物的排序。在高浓度的 dBET6下，由于三元复合体(靶蛋白:PROTAC:E3连接酶)的形成受阻(亦称为“hook effect”)，降解速率下降。

利用 Nano-GIo® HiBiT Extracellular Detection System，能够开发出操作简单、可定量测定受体内化的检测方法，可节省时间并消除基于抗体方法的变异性。使用经优化的检测试剂，可快速平衡表面受体，快速采集变化的生物学数据最大限度降低孔间变异性。

▍▏在几分钟内检测配体的效价和 GPCR 受体内化的程度

不同激动剂刺激β₂肾上腺素能受体(β₂adrenergic receptor，ADRB2)导致其内化。当作为外源标记的HiBiT 融合蛋白进行表达时，这个过程可以很容易地使用Nano-Glo® HiBiTExtracellular Detection System进行定量，因为 LgBiT 蛋白具有细胞非渗透性，只会结合到表面受体上。

在基于均质多孔板的实验中测定不同 ADRB2 受体激动剂的效价(EC₅₀)，并分别计算受体内化程度。ADRB2 的已知激动剂促进了受体的内化，其效价的等级顺序差异符合预期。此外，部分激动剂沙丁胺醇和沙美特罗的内化程度也出现了预期的降低。

▍▏实时监测活细胞受体转运

加入纯化的 LgBiT 蛋白和活细胞底物(或长时间底物)，即使在内源性表达水平也能够实时分析受体转运的动力学。细胞与 LgBiT 和底物预孵育后，激动剂福莫特罗诱导 ADRB2 受体内化。这导致发光信号减少，可能是由于较低的体内 pH 或底物利用率对 NanoBiT萤光素酶活性的影响。加入拮抗剂普萘洛尔可终止内吞作用，导致受体逐渐循环返回至表面，如信号增加(红色所示)，而未经普萘洛尔处理后该受体水平仍较低(灰色所示)。

与工作负荷较高的ELISA方法相比，HiBiT蛋白标签系统提供了一种更快、更灵敏和更稳定的方法来监测进出细胞表面的受体。

▍▏靶细胞杀伤

利用人体自身的免疫系统抗癌,是一个有前景的新策略。目前已有多种引导特异性免疫效应细胞杀死肿瘤靶细胞的方法。

因此，该领域的研究需要用到在共培养环境中特异性检测靶细胞群死亡情况的技术。然而，目前的方法要么缺乏特异性(如乳酸脱氢酶释放试验)，要么需要放射性标记(如铬-51 释放细胞毒性试验)，都需要专门仪器或工作流程繁琐,。迄今为止研发的各种治疗策略包括:

▍▏利用 HiBiT 技术检测共培养靶细胞杀伤的原理

HiBiT 靶细胞杀伤作用测定是基于膜完整性丧失后从靶细胞释放 HiBiT 融合蛋白。通过添加不透膜 LgBiT 蛋白，可轻松检测到靶细胞释放 HiBiT 融合蛋白。不透膜 LgBiT 蛋白立即与细胞外 HiBIT 结合，重构 HiBiT: LgBiT 萤光素酶产生生物发光信号。信号与靶细胞死亡量成正比。靶细胞被设计为异位表达 HaloTag® -HiBiT，由此 HaloTag®融合能够使用荧光的 janelia Fluor® 646 HaloTag®Ligand，通过 FACS 进行荧光成像和阳性克隆分离。或者，可采用 CRISPR技术将 HiBiT 添加到常用的细胞死亡胞质蛋白标记物乳酸脱氢酶(LDH)的内源性位点。

▍▏抗体依赖性细胞介导的细胞毒性作用（ADCC）

将稳定表达 HaloTag®-HiBiT融合蛋白的A549细胞(2,500个细胞/孔)与作为效应细胞的原代外周血单核细胞一起孵育，效应细胞:靶细胞比率为20:1时，加入不同浓度的治疗性抗体西妥昔单抗孵育5小时。使用 Nano-Glo® HiBiT Extracellular Detection System 检测 ADCC 对靶细胞的杀伤作用。

(A)双特异性T细胞结合子(BiTE)类似于两种不同单克隆抗体的两个单链可变片段(scFv)的融合物。BiTE 通过同时结合工细胞和肿瘤特异性抗原，将下细胞毒性重定向至肿瘤细胞。例如，Blincvto ®与T细胞上的 CD3和肿瘤细胞上的 CD19 结合。使用稳定表达 HaloTag®-HiBiT 融合蛋白的靶细胞，能够在存在活化的 TALL-104 CD8⁺效应T细胞的情况下选择性测定 Blincyto ®诱导的靶细胞杀伤作用。(B)可以通过添加 Nano-Glo”Endurazine™ Live Cell Substrate 和不透膜 LgBiT 蛋白对该过程进行实时监测。

▍▏CAR-T 细胞疗法

采用Nano-Glo® HiBiT Extracellular Detection System进行终点法检测 CAR-T 细胞介导对表达 CD19⁺K562 靶细胞的 HaloTag®-HiBiT的杀伤作用。将靶细胞(2,500个细胞/孔)与抗-CD19 CAR-T细胞(ProMab;PMCAR1003)按不同的效靶细胞比率孵育24小时：在不存在效应细胞的情况下测定自发释放(SR)引起的背景发光。