【Promega】Anti-HiBiT Monoclonal Antibody

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Anti-HiBiT Monoclonal Antibody：一种抗 HiBiT 单克隆抗体将 HiBiT 标签的用途扩展到其他表位标签之外

1.背景介绍

HiBiT 是一种 11 个氨基酸的多肽标签，使用 NanoLuc BinaryTechnology(或称为 NanoBiT®)可以简单、灵敏地定量标记的蛋白质。其与大亚基(LgBiT)互补，可重组成明亮的萤光素酶促进蛋白质动力学的测定，包括表达水平、降解、易位和翻译后修饰。然而，LgBiT 亚基不能支持传统上用抗体完成的几种理想的检测模式，例如免疫荧光成像或免疫沉淀。

为了将 HiBiT 的功能扩展到包括传统的免疫测定，我们力求开发一种针对 HiBiT 的特异性、高亲和力的小鼠单克隆抗体。我们对抗体进行了免疫印迹、免疫荧光染色、免疫沉淀和FACS 验证。

Anti-HiBiT 抗体也比常用的表位标签抗体结合更紧密，在免疫分析中通常表现出更高的灵敏度或特异性。

HiBiT 是目前唯一的在检测选择上具有最大灵活性的小肽标签用户可以很容易地使用定量的、生物发光的、基于细胞的检测方法和执行传统的基于抗体的方法测定蛋白质。HiBiT 标签的高实用性消除了对串联标记方法的需求。

Anti-HiBiT 单抗与其他表位标签抗体相比的优势:

●免疫荧光:对内源性表达的 HiBiT 标记蛋白可进行荧光显微成像。

●FACS:可用于分离表面表达 HiBiT 的活细胞，或在固定的渗透细胞中定量 HiBiT 标记的蛋白。

●Western blotting:以最小的交叉反应检测低至皮克的 HiBiT 标记蛋白。

●免疫沉淀:从样品中快速沉淀高比例的 HiBiT 标记蛋白。

●亲和力高:Anti-HiBiT mAb 与 HiBiT 的结合比 LgBiT高 2个数量级。

2. 拓展 HiBiT 工具箱

虽然 LgBiT 互补能够简单、灵敏地定量HiBiT 标记的蛋白，但一种特异性、高亲和力的单克隆抗体将使 HiBiT也能支持传统表位标签的所有应用。

3. 内源性表达 HiBiT 标记蛋白的荧光成像

将 HiBiT 添加到 HeLa 细胞中具有不同亚细胞定位的内源性蛋白位点，并用抗 HiBiT 单抗对细胞进行免疫染色 ( 红色 )。

4.用表达在细胞膜表面的HiBiT对活细胞进行 FACS 分选或用表达在细胞内的HiBiT对固定细胞进行定量

荧光活化细胞分选可用于在固定细胞、通透化细胞中定量细胞内的 HiBiT 标记蛋白，或用于分离表面表达 HiBiT 标记蛋白的活细胞。

5. 进行免疫印迹检测时，皮克级的灵敏度，且特异性好

●个位数皮克级的 HaloTag-HiBiT 可以通过 WB 检测到，HeLa 裂解物中的交叉反应带的信号小于 1pg 的 HiBiT 融合蛋白(图 1)。

●经 CRISPR 修饰的 HeLa细胞，其在内源性水平表达的 HiBiT 标记蛋白可以通过 WB 检测到(图 3)。

6.与其他表位标签相比，Anti-HiBiT mAb Westerm Blotting 具有更高的灵敏度和特异性

使用制造商推荐的方案，通过 Western Blotting 分析表达用 HiBiT 加另一个表位标签串联标记的 HSP90B1 的 CRISPR 池的裂解物,箭头表示预期条带。

7.比其他单拷贝表位标签更有效的免疫沉淀

●使用 CRISPR/Cas9 对 HSP90B1 进行串联标记:HiBiT+ HA、Myc、1或3个拷贝的 FLAG 标签。

●从 CRISPR 池中产生裂解物并分离以制备 IP 样本。

●标记的 HSP90B1 用 Anti-HiBiT、Anti-Myc、Anti-HA或 Ant-FLAG 抗体进行免疫沉淀，偶联磁性蛋白G 树脂。

●HiBiT 的性能与 3xFlag 相似，优于单拷贝标签。

8.Anti-HiBiT 单克隆抗体会以皮摩尔量级与 LgBIT 竞争性结合 HiBiT

梯度浓度的抗体与 10 pM 的 HiBiT 肽或 HaloTag-HiBiT 蛋白共孵育达到平衡。通过加入含有饱和的 LgBiT 和 furimazine 的 HiBiT检测试剂，并检测发光来测定未结合 HiBiT 的比例。

产品列表

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* 包括 10mL Nano-Glo® HiBiT 裂解检测系统

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PBMC ADCC Bioassay Kit (A549)	1 kit*
PBMC ADCC Bioassay Kit (H929)	1 kit*
PBMC ADCC Bioassay Kit (SK-BR-3)	1 kit*
*包括细胞培养基、胎牛血清（FBS）和 10mL Nano-Glo® HiBiT 细胞外检测系统。