【Merck】Amicon® Ultra超滤管应用方案：纳米颗粒/微球的纯化
纳米颗粒/微球的纯化
超滤法快捷分离、换液与浓缩
纳米颗粒 (Nano-sized particle, NP) 可采用有机 / 无机材料、聚合物和金属制造，在材料科学、环境科学等行业中有多样化的用途。近年来，通过表面改性赋予纳米颗粒特定的生物学功能并增强生物相容性，在药物开发、生物诊断与治疗等医学领域作为载体和传感器的应用突飞猛进，常见的有生物成像、生物传感、靶向药物递送、药物控释等等。
参考文献
1.Fang RH, Aryal S, Hu CJ, Zhang L. 2010. Quick Synthesis of Lipid?Polymer Hybrid Nanoparticles with Low Polydispersity Using a Single-Step Sonication Method. Langmuir. 26(22):16958-16962. https://doi.org/10.1021/la103576a
2.Reddy LH, Arias JL, Nicolas J, Couvreur P. 2012. Magnetic Nanoparticles: Design and Characterization, Toxicity and Biocompatibility, Pharmaceutical and Biomedical Applications. Chem. Rev.. 112(11):5818-5878. https://doi.org/10.1021/cr300068p
3.Weingart J, Vabbilisetty P, Sun X. 2013. Membrane mimetic surface functionalization of nanoparticles: Methods and applications. Advances in Colloid and Interface Science. 197-19868-84. https://doi.org/10.1016/j.cis.2013.04.003
纳米颗粒分离、纯化和浓缩的超滤技术
就纳米材料的生产而言，高效的颗粒收集和制备方法非常关键。磁性纳米颗粒、量子点、金属纳米颗粒、二氧化硅纳米颗粒、聚合纳米颗粒是生物医学常用的材料。
粗制的纳米颗粒很多不能直接使用。其水相基质中可能含有需要去除的未结合药物，裂解物、体液、血清、缓冲液、培养基等试剂中的生物分子、化学品和其它污染物也需要进一步分离，其中某些物质会对周围的生物环境造成不利影响。因此，浓缩、富集、洗涤和纯化纳米颗粒的可靠方法在这种新材料的应用中发挥越来越重要的作用。
超滤 (Ultrafiltration, UF) 技术广泛用于纳米颗粒合成后的制备和纯化。过去一直采用加压超滤装置 (pUF)，之后引入的离心超滤 (cUF) 适合小体积的纳米颗粒制备和纯化。
超滤膜的选择
初步过滤后，可进一步通过离心对纳米颗粒进行洗涤和缓冲液置换或再浓缩。对截留或滤过的溶质可收集并分析，测定纳米颗粒的纯度、包封效率、结合性和药物浓度。
超滤主要通过基于大小的筛分作用分离和浓缩分子。大部分生物分子的分子量均低于 500kDa，正好是纳米颗粒的大小范围。默克生命科学的 Amicon® Ultra 超滤管等带有的再生纤维素超滤膜具有均匀的特定截留分子量 (nominal molecular weight limits, NMWL)，即超滤膜应该截留至少 90% 以上的截留分子量大小的颗粒。这些超滤系统滤膜的截留分子量有 3kDa、10kDa、30kDa、50kDa 和 100kDa。一项针对纳米颗粒制备发表论文的调查表明，按照纳米颗粒大小和应用选择适当的滤膜孔径比较复杂，需要在具体条件下进行选择和尝试。
分析 1988~2019 年间 421 篇关于纳米颗粒用超滤法处理的文献，统计整理不同类型材料用到的截留分子量数据如下：
应用实例
脂质 - 聚合物杂化纳米颗粒（LPN）的制备
LPN已被用于输送药物，如多西他赛，紫杉醇，姜黄素和多柔比星等，也用于各种疾病适应症的诊断分子。这些纳米颗粒的特性使其成为药物输送应用的理想选择，包括加载多种药物的能力，精确控制药物负载和药物释放，以及通过靶向部分功能化。
尽管LPN 以前已使用两步合成方法配制，但新的一步合成法更简便且可重复性更好。这种方法产生的 LPN 在尺寸上多分散性较小，并且可以精确控制其物理化学性质。
LPN 由大豆卵磷脂，DSPE-PEG 和 PLGA 采用一步纳米沉淀法结合自组装合成
（来自南洋理工大学 Juliana Chan 教授的研究小组）
1.通过将以下内容添加到玻璃小瓶（乙醇，Sigma-Aldrich Cat#E7023）：
• 大豆卵磷脂由 90-95% 磷 脂 酰 胆 碱 组 成（MP Biomedicals）
• DSPE–PEG2000–COOH（1,2- 二硬脂酰基 -sn- 甘油 3-磷酸乙醇胺 -N- 羧基（聚乙二醇）2000）（(Avanti）。大豆卵磷脂 /DSPE-PEG 摩尔比的范围可以从 7:3 到8.5:1.5.
2.有机溶液是通过向水溶性有机溶剂（如乙腈）中加入以下内容来制备的：
• 聚（d，l- 丙交酯 - 共乙交酯）（PLGA），单体比例为 50:50，酯封端，粘度为 0.72– 0.92 dl/g（Durect Corporation）。改变单体比例和粘度将产生具有不同尺寸、生物降解速率以及药物负载和释放特性的 LPN。
• 小分子药物，如多西他赛。
初始药物重量不得超过聚合物重量的 10-30%，药物才能被聚合物正确封装。脂质 / 聚合物重量比范围为 15%-20%。
- 将水溶液在加热板搅拌器上在温和搅拌条件下加热至65°C 3-5min。
- 一旦达到反应温度，在温和搅拌条件下将有机溶液滴加到水溶液中，然后立即剧烈涡旋 3min。
- 将混合物返回到温和搅拌条件，并使 LPN 在室温下自组装2 小时。
- 使用截留分子量为 10 kDa 的 Amicon® Ultra-4 超滤管（Millipore）洗涤 LPN 三次。将洗涤后的 LPN 以最终所需浓度重新悬浮在水或缓冲液中。
- LPN 立即使用，在 4°C 下储存过夜，或冻干以在–80°C 下延长储存。
此后的样品的换液、过滤和浓缩，都可以借助 Amicon®Ultra 系列超滤管方便地处理。
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