【Merck】Amicon® Ultra超滤管应用方案：超滤法浓缩病毒和噬菌体

我们开发了两种新方法，将超滤法作为获得高滴度病毒的快速且具有成本效益的方法。超滤可用于浓缩来自细胞培养上清液、色谱分离组分、环境来源等的病毒。

选择合适的设备、膜材料、截留分子量（MWCO）、离心速度和时间对于实现感染性病毒颗粒的高回收率至关重要。Amicon® Ultra和Centricon® Plus-70离心超滤管采用Ultracel® 再生纤维素膜，已成功浓缩噬菌体、腺病毒、慢病毒和腺相关病毒等。

噬菌体在近一个世纪前首次被发现。从那时起，噬菌体生物学引起了研究人员的注意，因为它们具有可用于治疗人类感染的有效杀菌能力。噬菌体和动物病毒已成功用作DNA载体或克隆载体。基于lambda25,000 bp的DNA噬菌体的载体的优势在于它们可以携带高达片段。噬菌体展示则是从cDNA文库中克隆蛋白质的新型遗传选择系统。此外，噬菌体和动物细胞病毒之间还有许多相似之处。因此，噬菌体可以被视为动物细胞病毒的模型系统。

标准的噬菌体繁殖方法通常涉及宿主细菌的感染，细菌生长12-16小时后从上清液中回收噬菌体。噬菌体的纯化通常包括密度梯度离心、长时间透析，然后通过空斑试验测定噬菌体滴度。

在某些实验中，需要高滴度的噬菌体原液。传统方法是将噬菌体颗粒通过聚乙二醇（PEG）和葡聚糖硫酸盐沉淀、酸沉淀或差分或平衡离心浓缩。最近，人们在Sambrook方法基础上做了不同改进，通过氯化钠和PEG沉淀浓缩噬菌体，并重悬至所需滴度。该过程需要用PEG孵育6-12小时，并进行漫长的颗粒重悬过程，以实现高颗粒回收率。

超滤是实现高噬菌体滴度的替代方法。当不需要从细胞和培养基蛋白中完全纯化时，可以使用离心超滤快速浓缩噬菌体。超滤也可用于浓缩环境来源的噬菌体。对于大体积裂解物，Amicon® 搅拌式超滤杯是更好的选择。

正确的膜材料、孔径、离心速度或压力以及最终截留体积对于获得高噬菌体回收率和保持其感染性是关键要素。如下操作方法描述了使用Millipore® 超滤装置来浓缩Pseudomonas pseudoalcaligenes（假单胞菌假碱性噬菌体phi-6），一种包膜dsRNA病毒。病毒粒子是球形的，直径为86nm。

phi-6的制备

注意：所有操作都应在超净工作台中使用无菌技术进行。

1.培养假碱假单胞菌的新鲜培养物，直到600nm吸光度达到0.1。

2.用足够的phi-6接种培养物，感染复数（MOI）达到0.5。

3.将含有假单胞菌假碱性培养物的phi-6放回摇床中，在26°C 125RPM下孵育18-24小时。

4.孵育过夜后，将培养物分装到四个250 mL离心瓶中。

5.将瓶子以16,000 x g离心30分钟。

6.取出上清液并转移到无菌容器中。

使用具有50 kDa NMWL膜的Amicon® Ultra-4或Ultra-15超滤管进行浓缩。

1.使用Millipore® 带有低吸附0.22μm PES膜的无菌过滤装置，Stericup® 无菌过滤杯(目录号S2GPU05RE），Steriflip® 过滤器（目录号SCGP00525），或Millex-GP® 针头式过滤器（目录号SLGPR33RB）对phi-6上清液进行过滤澄清。

2.将适量经澄清的phi-6上清液（4或15mL）加载到带有50,000NMWL再生纤维素膜的Amicon® Ultra-4 超滤管（目录号UFC805096）或Amicon® Ultra-15超滤管（目录号UFC905096）上。

3.将超滤管（4或15 mL）以1,500 × g离心15分钟。

4.Amicon Ultra®-4超滤管样品回收体积为80–100μL，Amicon® Ultra-15 超滤管回收体积为350–500μL。

注意：避免将样品浓缩到推荐体积以下，以免导致噬菌体回收率降低。

结果

采用Ultracel® 再生纤维素膜的Millipore® 超滤装置具有低非特异性结合和高截留物回收率的显著优点。竖膜设计可减少浓度极化，实现超快的浓缩，特别适用于浑浊和粘稠溶液。

如实验方案所示，通过离心超滤，噬菌体滴度可在15 分钟内增加多达30倍，样品体积可达15 mL。50 kDa 的Amicon® Ultra-4和Ultra-15超滤管可以成功地用于将噬菌体phi-6从细菌培养上清液中浓缩出来。不建议使用100 kDa的超滤管，病毒会漏到滤液中而降低回收率。

简介 

尽管基因组学进展迅速，但大多数人类基因的生物学功能仍然未知。特别是在寻找改进人类疾病治疗的新靶点时，基因功能的鉴定是一个越来越受到关注的问题。功能基因组学方法旨在通过生物系统中诱导的表型鉴定基因，需要在基于细胞的测定中在基因组规模上测量基因功能。代表给定细胞/组织类型中表达基因群的cDNA表达文库通常已被克隆到质粒中，通过瞬时转染引入细胞。然而，不同细胞类型的转染效率差异很大。因此，已经开发了多种病毒来源的载体系统，用于改善哺乳动物细胞中的cDNA转导、表达和筛选。这些系统包括COS细胞中的猿病毒40复制子(SV40)以及源自逆转录病毒、杆状病毒、甲病毒、人类免疫缺陷病毒、牛痘病毒、腺病毒和腺相关病毒（AAV）的cDNA克隆和表达载体。

在临床试验中使用病毒载体相关的挑战包括生产足够数量的临床级材料和维持病毒载体的生物安全性。病毒载体的生产和纯化在方法和病毒产量和质量方面各不相同。

病毒载体的生成和纯化是劳动密集型的且昂贵的，并且可能需要特殊设备（如超速离心机）。纯化腺病毒、慢病毒和AAV的标准方法是使用密度梯度超速离心，然后进行长时间透析。近年来柱或膜层析已成为腺病毒纯化的首选方法。病毒的产量通常通过空斑试验、TCID50测定和ELISA来确定。对于大多数应用，重组病毒必须纯化至高滴度。为了获得高滴度原液，通常需要浓缩纯化的病毒颗粒。

如下方法描述了使用Amicon® Ultra离心超滤装置浓缩三种常见的病毒类型：慢病毒，腺病毒和腺相关病毒（AAV）。

图1.慢病毒感染大鼠皮质神经元的原代培养

病毒繁殖采用辅助质粒和表达copGFP（System Bioscience）的慢病毒质粒转染HEK-293T细胞。转染48小时候收集转染病毒上清液，使用100 kDa Amicon® Ultra-15超滤管将10 mL浓缩至200 μL。50 μL浓缩病毒原液用于10E6 细胞的感染。数据由Beth Israel Medical Center神经保护实验室Leila Aminova和Ambreena Siddiq博士提供。

方法

1.包装细胞：宿主细胞铺板以达到80-85%的汇合度。

2.转染：细胞转染重组质粒或感染活病毒颗粒。

3.收获病毒：根据病毒的不同，使用细胞上清液或沉淀细胞或两者兼而有之来纯化重组病毒粒子。通常应用三到四轮冻融循环从细胞中释放病毒。然后通过离心或预过滤将细胞碎片与细胞裂解物分离。

4. 病毒纯化：通过密度梯度超速离心或柱/膜层析从细胞裂解物中纯化病毒。在某些情况下可以使用肝素或粘蛋白琼脂糖的亲和色谱。然后将纯化的病毒溶液通过透析或渗滤完成将缓冲液置换成适当的储存溶液。

5.病毒浓缩：为了获得高滴度的病毒原液，可以使用离心超滤浓缩纯化的病毒。

备注：正确选择设备、膜材料、MWCO、离心速度、离心时间和缓冲液组成对于感染性病毒颗粒的高回收率至关重要。Amicon® Ultra超滤管采用50 KDa NMWL Ultracel® 再生纤维素膜，已被证明可以成功浓缩腺病毒和AAV溶液。对于慢病毒浓度，可以使用50 KDa和100 kDa膜的超滤管。

结果

表2显示了粗制细胞裂解物和色谱纯化的病毒中腺病毒、慢病毒和AAV浓度的典型结果。

请特别注意大多数病毒不能有效地浓缩并储存在低盐缓冲液中。

病毒在浓度为<250mM盐浓度的溶液中离心将导致病毒聚集和传染性降低。推荐储存溶液配方是：20mM Tris、pH 8.0、250mM NaCl、5%山梨糖醇和 0.001% PF68（多聚糖酸）。

浓缩的病毒原液也可以通过0.22 μm过滤器进行过滤灭菌。例如，无菌Steriflip-GP® 过滤装置（目录号SCGP00525）可用于50mL或以下的体积或Ultrafree® MC GV（目录号UFC30GV0S）可用于体积<0.5mL的样品。对于较大体积的样品，则可使用70%消毒处理过的Amicon® Ultra或Centricon® Plus 70超滤管浓缩。

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