【Merck】全套的Protein A/G产品

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Merck 11243233001 16-266 P3296 LSKMAGG02 11134515001 P6486 16-156 P3476 P9424 LSKMAGA02 IP10 LSKMAGAG02 LSKMAGKP02 LSKMAGLM02 IP05 264101 264103 428015 428016 P8340

免疫共沉淀法（Co-IP法）

原理：

免疫共沉淀法（Co-immunoprecipitation法）是以抗体与抗原特异性结合为基础的用于研究蛋白质互作的经典方法。

当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质互作复合物被保留了下来，然后利用固定在琼脂糖珠或磁珠等固相支持物上的特异性抗体，从细胞或组织裂解物中把这些蛋白复合物分离出来，进行WB或其他检测。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。

优点：

•互作的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态

•蛋白的互作是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响

•可以分离得到天然状态的互作蛋白复合物

缺点：

•可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质互作

•两种蛋白质的结合可能不是直接结合，可能有第三者在中间起桥梁作用

•必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，若预测不正确，实验就得不到结果

应用分类：

Co-IP通常分为内源性蛋白互作验证和非内源性蛋白互作验证。内源性蛋白Co-IP实验通常依赖能够特异性识别靶蛋白的抗体。而对于非内源性蛋白，由于没有相应的可用于IP的抗体，目前主要是通过标签标记外源蛋白。

— 抗体结合内源蛋白免疫沉淀

微生物来源的Protein A和Protein G对于哺乳动物免疫球蛋白(Ig)有特异性结合能力，依抗体亚型不同结合力有所不同。这两种蛋白包被到琼脂糖或磁珠等载体上固定化后，就成为抗体结合内源蛋白免疫沉淀中最为常用的操作工具。

— 标签融合蛋白免疫沉淀

利用基因工程技术使目标蛋白带上一段特定的氨基酸序列，形成标签与目标蛋白的融合蛋白，并采用针对标签序列的特异性抗体进行亲和结合。免疫沉淀通常选用的标签有FLAG，His，GST，HA，c-My等。

下面介绍用Protein A/G琼脂糖做抗体结合内源蛋白免疫沉淀的操作方法：

需要的耗材及设备

• Protein A/G琼脂糖（货号IP05）

• 单抗或多抗

• PBSTDS：100ml PBS与10ml 100% TRITON X-100（目录号648462）混合，5g脱氧胆酸钠（目录号264101或264103），1g SDS（目录号428015或428016)，蛋白酶抑制剂（目录号P8340），加蒸馏水至1L

• 小型离心机

• 1.5mL离心管

• 摇板

操作指南

1. 在免疫沉淀前对裂解液或条件培养基进行预清除，可以在样品中加1μg选定物种IgG以及20μl IP05琼脂糖，这个步骤可以去除非特性沉淀蛋白，以减少免疫沉淀污染成分。

2. 4°C孵育1hr，1500rpm离心沉淀琼脂糖，小心收集并保留上清，用于免疫沉淀。

3. 测定样品中的总蛋白。

4. 在小离心管中加入细胞裂解液（约10μg蛋白），1μg纯化的一抗（单抗或多抗），15μl IP05琼脂糖，盖上试管盖，放入一个袋子，置于摇板上4°C孵育2-24hr。注意：可根据抗体和样品的实际情况相关经验调整。

5. 小离心机4°C 2500rpm离心15min收集免疫沉淀。

6. 小心吸取移除上清，用PBSTDS洗涤沉淀，每次1ml，重复进行洗涤/离心，一共4次。

7. 最后一次洗涤后去掉上清，用40-50ml SDS-PAGE上样缓冲液重悬沉淀。

8. 采用SDS-PAGE及Western blotting检测。

▲tips：

• 此操作方法也可用于放射性氨基酸（如14C或3H) 或32P正磷酸盐标记的细胞。细胞标记需要在缺乏相应氨基酸或磷酸的培养基上进行。

• 在WB检测时请使用与IP不同物种来源的抗体，以避免二抗检测时发生干扰，选择检测系统对应的直接标记的一抗或生物素标记的一抗（链亲和素检测）是不错的选择。

• 用于吸取浓缩的琼脂糖溶液的枪头最后去除掉尖端约5mm。

默克提供全套的Protein A/G产品

类型	产品描述	包装	目录号
Protein G	Protein G Agarose	5mL	11243233001
高流速Protein G	Protein G Agarose, Fast Flow	10mL	16-266
高流速Protein G	Protein G Sepharose®, Fast Flow	1mL, 5mL	P3296
Protein G磁珠	PureProteome™ Protein G Magnetic Beads	2×1mL	LSKMAGG02
Protein A	Protein A Agarose	5mL	11134515001
红色Protein A	EZview™ Red Protein A Affinity Gel	1mL, 5×1mL	P6486
高流速Protein A	Protein A Agarose, Fast Flow	10mL	16-156
	Protein A–Agarose Fast Flow	1mL, 5mL	P3476
	Protein A-Sepharose® 4B, Fast Flow from Staphylococcus aureus	1mL, 5mL	P9424
Protein A磁珠	PureProteome™ Protein A Magnetic Beads	2×1mL	LSKMAGA02
Protein A/G	Protein G Plus/Protein A-Agarose	10mL	IP10
Protein A/G 磁珠	PureProteome™ Protein A/G Mix Magnetic Beads	2×1mL	LSKMAGAG02
抗体片段纯化磁珠	PureProteome™ Kappa Ig Binder Magnetic Beads	2×1mL	LSKMAGKP02
抗体片段纯化磁珠	PureProteome™ Lambda Ig Binder Magnetic Beads	2×1mL	LSKMAGLM02