【Merck】核蛋白提取操作指南
核蛋白为结合蛋白质中的一类。普遍存在于各种生物的细胞核中的特殊形态的蛋白质，由核酸与组蛋白、精蛋白等的碱性蛋白结合而成为细胞核的主要成分。核蛋白的核酸与生物遗传与蛋白质生物合成关系密切，所以有关核蛋白结构与功能的研究十分活跃。
下面介绍的提取方法可用于从多种细胞类型中进行功能型粗制核蛋白的提取:
需要的耗材及设备
●CelLyticTm核蛋白抽提试剂盒(货号NXTRACT)
●离心机(Eppendorf带A-4-62或类似转子)和配套离心管
●小离心机(Eppendorf 5417R或类似离心机)和配套离心管
●玻璃组织匀浆仪(研磨管和B型)(可选)
●显微镜,载玻片(货号S8902),盖玻片(货号C9802)
●1ml吸管(货号Z230723)
●精密滑针SS,27 gauge (货号Z192376)
●细胞刮(货号C2802)
●PBS(货号D8537)
●台盼蓝溶液(货号T8154)
●4-(2-Aminoethyl) benzenesulfonyl fluoride (AEBSF)(货号A8456)
●玻璃组织匀浆仪(研磨管和B型)(可选)
CelLytic™ NuCLEAR™提取试剂盒已经在HeLa、CHO、COS、PC-12、Jurkat和牛主动脉内皮细胞（BAEC）中测试过且效果很好。可从少量的细胞（106-107细胞，20-100µl的收集细胞体积）或更大量的细胞（108-1010细胞，~1ml的收集细胞体积）提取核蛋白。可提取自以下新鲜或冷冻组织：小鼠大脑和肺、大鼠肝脏和兔肌肉。蛋白提取物可用于利用凝胶迁移率测定进行的DNA-蛋白互作检测、DNase I足迹分析及其他相似技术。
操作指南
一、从100µl收集细胞体积中使用除垢剂（IGEPAL CA -630）进行核蛋白提取
需根据不同的收集细胞体积进行相应计算。
1. 用无菌的去离子水将1M DTT溶液稀释至0.1 M的浓度。对于小规模的制备（低于100µl总量），1M DTT储备液应稀释至0.01M。
2. 通过无菌去离子水将10X低渗裂解液稀释10×至1X低渗裂解液。对于脆弱型细胞，可将5X等渗裂解液稀释成1X等渗裂解液，来替换1X低渗裂解液。向500µl的1X裂解液（无论是低渗或是等渗）中加入5µl制备好的0.1M DTT溶液和5µl的蛋白酶抑制剂混合物。
3. 收集细胞
a.来自70-90%汇合度的单层培养贴壁细胞。
• 将培养细胞的生长培养基吸走。
• 用PBS冲洗细胞2次，注意不要将细胞冲走。
• 吸走PBS。
• 用新鲜的PBS将细胞刮至一支合适的锥形离心管中。
• 450xg离心5min。
• 弃上清。
b.悬浮细胞
• 将细胞收集至一支合适的锥形离心管中。
• 450xg离心5min。
• 弃上清。
• 用PBS重悬细胞沉淀并冲洗2遍， 450xg离心5min。
• 弃上清。
4. 预估收集的细胞体积（PCV）。
5. 将500µl（5XPCV）的1X裂解液（包含DTT和蛋白酶抑制剂）加入至100µl的PCV中。温和重悬细胞沉淀。避免形成泡沫。如果是小量应用，可将重悬细胞转移至一支微量离心管中。
6. 将收集的细胞在特定的裂解液中冰上孵育15min，让细胞发生膨胀。取几微升裂解液中的细胞并在显微镜下进行观察。
7. 向裂解液中已膨胀的细胞中加入10% IGEPAL CA-630溶液至0.6%（每100µl混合液中6µl）的终浓度。剧烈涡旋10s。
8. 立即10,000-11,000xg离心30s。
9. 将上清转移至一支新管中。该组分为细胞质组分。
10.向98µl的提取缓冲液中加入1µl制备好的0.1M DTT溶液和1µl蛋白酶抑制剂混合物。如果需要以更低的盐浓度进行目标蛋白提取，可用1X稀释/平衡缓冲液将提取缓冲液进行稀释。
11.用~70µl（2/3X PCV）含DTT和蛋白酶抑制剂混合物的提取缓冲液，重悬粗制的细胞核沉淀。
12.将管子插入到涡旋混合仪上，中高速搅动15-30min。避免形成泡沫。
13.20,000-21,000xg离心5min。
14.将上清转移至一支洁净、预冷的管中。
15.用液氮快速冷冻分装好的上清，–70°C储存。
二、不使用去污剂，从200µl收集细胞进行核蛋白提取
根据不同的收集细胞体积进行相应计算。
去污剂会对所提取蛋白的活性或结合产生干扰。因此，这里也提供了一种不使用去污剂进行核蛋白提取的实验方案。该方案描述了如何使用加样针或玻璃组织匀浆仪制备粗制细胞核提取物。
1. 用无菌的去离子水将1M DTT溶液稀释至0.1M。
2. 制备1X低渗裂解液。对于来自脆弱型细胞的蛋白提取物，可制备1X等渗裂解液来替代1X低渗裂解液。向1,400µl的1X裂解液（低渗或等渗）中加入14µl制成0.1M DTT溶液和14µl蛋白酶抑制剂混合物。
3. 收集细胞
a.来自70-90%汇合度的单层培养贴壁细胞。
•将培养细胞的生长培养基吸走。
•用PBS冲洗细胞2次，注意不要将细胞冲走。
•吸走PBS。
•用新鲜的PBS将细胞刮至一支合适的锥形离心管中。
•450xg离心5min。
•弃上清。
b.悬浮细胞
•将细胞收集至一支合适的锥形离心管中。
•450xg离心5min。
•弃上清。
•用PBS重悬细胞沉淀并冲洗2遍，450xg离心5min。
•弃上清。
4. 预估收集的细胞体积（PCV）。
5. 将1ml（5XPCV）的1X裂解液（包含DTT和蛋白酶抑制剂）加入至200µl的PCV中。温和重悬细胞沉淀。避免形成泡沫。如果是小量应用，可将重悬细胞转移至一支微量离心管中。将收集的细胞在裂解液中孵育15min，让细胞发生膨胀。
6. 将重悬细胞420xg离心5min。弃上清并用400µl（2XPCV）的1X裂解液重悬收集的细胞沉淀。
7. 细胞破碎
a.使用玻璃组织匀浆仪，将细胞转移至玻璃组织匀浆仪中。在冰上使用B型杵上下击打5次来缓慢的进行研磨。避免形成泡沫。或者
b.使用带有窄孔（27#）皮下针的加样针，用1X裂解液充满加样针。利用加样针柱塞尽可能完全推动缓冲液。此操作可把加样针中的空气全部排出，并防止多余的空气在裂解的过程中进入到细胞悬浮液中。将细胞悬浮液缓慢抽取到加样针中，随后一次性快速推 出。重复5次。
8.将悬浮液中破碎的细胞10,000–11,000xg离心20min。
9.将上清转移至一支新管中。该组分为细胞质组分。
10.向147µl的1X提取缓冲液中加入1.5µl制成0.1M DTT溶液和1.5µl蛋白酶抑制剂混合物。如果需要以更低的盐浓度进行目标蛋白提取，可用1X稀释/平衡缓冲液稀释提取缓冲液。
11.用~140µl（2/3XPCV）含有DTT和蛋白酶抑制剂的提取缓冲液重悬粗制的细胞核沉淀。如果该过程采用组织匀浆仪进行，则推荐在此处进行额外的10次重复。
12.轻轻振荡30min。
13.20,000-21,000xg离心5min。
14.将上清转移至一支洁净、预冷的管中。
15.用液氮快速冷冻分装好的上清，–70°C储存。
三、从100mg组织进行核蛋白提取
根据不同的组织重量进行相应计算。
1. 用无菌去离子水将1M DTT溶液稀释至0.1M。
2.制备1X裂解液。
3. 用PBS缓冲液冲洗组织2遍。弃PBS。
4. 用1,000µl（5X PCV）的1X裂解液（含有DTT和蛋白酶抑制剂）温和重悬组织。
5. 对组织进行匀浆，直至超过90%的细胞已经破碎并在显微镜下可观察到细胞核。
6. 将悬浮液中的破碎细胞10,000–11,000xg离心20min。
7. 将上清转移至一支新管中。该组分为细胞质组分。
8. 向147µl的提取缓冲液中加入1.5µl制备好的0.1M DTT溶液和1.5µl蛋白酶抑制剂混合物。
9. 用~140µl（2/3XPCV）含DTT和蛋白酶抑制剂的提取缓冲液重悬粗制的细胞核沉淀。此时可进行短暂匀浆以促进细胞核提取。
10.轻轻振荡30min。
11.20,000-21,000xg离心5min。
12.将上清转移至一支洁净、预冷的管中。
13.用液氮快速冷冻分装好的上清，–70°C储存。
四、脱盐
据此方法提取到的核蛋白悬浮在提取缓冲液中（一种高盐的缓冲液）。通常提取的蛋白是高度浓缩的，并可用低盐缓冲液（1X稀释/平衡缓冲液）进行稀释。由于仅需少量浓缩提取物便足够用于EMSA、足迹分析等检测，因此其中的高盐会被稀释。如果样品中的盐干扰下游实验，可使用透析或超滤快速脱盐。如果是通过透析除盐，采用与1X稀释/平衡缓冲液相似的透析缓冲液，内含终浓度1mM的DTT和蛋白酶抑制剂混合物或0.5mM AEBSF。
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