【Merck】GST标签融合蛋白的亲和纯化
谷胱甘肽巯基转移酶（GST）是一个相对较大的标签，分子量26kDa。在大肠杆菌增加可溶性表达和体外验证蛋白互作的pulldown中有特别的用途。已经建立天然条件的亲和纯化系统。由于分子量比较大，有较强的免疫原性，在制备抗体和蛋白结构研究时需要切除这个标签；而对于本身抗原性弱的肽/ 蛋白，保留GST 标签则有利于免疫动物、制备抗体。GST 与固定化谷胱甘肽（GSH）特异性结合，并以GSH 竞争洗脱。
下面介绍用GST●Bind树脂亲和纯化GST标签融合蛋白的操作方法：
需要的试剂及设备
• GST • Bind树脂（货号70541）
• 含表达GST标签融合蛋白的细胞样品
• 还原型谷胱甘肽，结合/漂洗/洗脱缓冲液
• 色谱柱
• 分光光度计
操作指南
一、柱层析
纯化及纯化前树脂在缓冲液中平衡都是室温条件下进行。GST•Bind树脂可以用于柱层析及批次操作。
1. 轻柔、充分翻转摇匀树脂悬浊液。用宽嘴吸头吸取所需体积的树脂浆（其中树脂为50%）。为了避免出现气泡，往柱子中添加树脂时将吸头尖端始终置于柱子液面以下。等待树脂沉降。
2. 当储存缓冲液（20%乙醇）液面降到柱床上沿以下时，用5倍体积1×GST结合/漂洗缓冲液洗树脂。
3. 待GST结合/漂洗缓冲液流到柱床上沿以下，加入制备好的蛋白抽提液。将流速控制在每小时10倍柱体积为宜。如果流速过快，洗脱的目的蛋白中会混入较多的杂质。收集穿过组分并置于冰上。
4. 以10倍体积1×GST结合/漂洗缓冲液洗柱，收集穿过组分并置于冰上。
5. 以3倍体积1×GST洗脱缓冲液洗脱目的蛋白。收集洗脱组分置于冰上待后续分析。
6.分析洗脱和穿过组分中出现的目的蛋白。若目的蛋白带的是无功能的GST则无法与树脂结合、纯化。
二、批次小量纯化
（一）机械裂解法或BugBuster抽提
1、 1.5ml离心管可以装50μl-200μl树脂，更大体积的纯化可以选用15ml或50ml无菌离心管。每次操作包括淋洗，加缓冲液，翻转数次混匀以及400–1000g离心1–5min。
2、轻柔、充分摇匀树脂悬浊液。用宽嘴吸头吸取所需体积的树脂浆（其中树脂为50%）。
3、采用上述要求的离心获得树脂沉淀。小心取走上清并丢弃。加5倍体积1X GST结合/漂洗缓冲液，翻转混匀并如前述离心。
4、丢弃上清，加入1倍体积1×GST结合/漂洗缓冲液翻转混匀，重悬树脂（现在50%体积为树脂）。
5、加入蛋白样本，室温下轻柔搅拌孵育30min。
6、如前述离心，将含未结合蛋白的上清移入另一离心管，冰上保存。用10倍体积1×GST结合/漂洗缓冲液重悬树脂，离心，移走上清。将淋洗所得上清置于冰上；总共进行两次淋洗操作。
7、洗脱结合于树脂上的蛋白时，加入1倍体积1×GST洗脱缓冲液，室温轻柔搅拌10min。离心后将含有目的蛋白的上清移入另一个离心管。再重复两次洗脱操作，可以将所有上清合并。
8、分析洗脱组分和步骤5所获得的组分中出现的目的蛋白。如果目的蛋白所带的是无功能的GST则无法与树脂结合并纯化。
（二）树脂的再生与储存
GST•Bind树脂可以重复使用数次而无需再生。但随着非特异性结合的蛋白的增多和蛋白的聚集，往往会造成流速和结合载量都下降。为了去除结合在树脂上的蛋白，可以用10倍体积的50mM Tris-HCl，0.5M NaCl，pH8.0洗树脂，接着用10倍体积的100mM醋酸钠pH4.5，0.5M NaCl再洗一次。其它可以用做去除污染蛋白的缓冲液还包括：6M尿素，6M盐酸胍或低极性溶剂，如50–70%乙醇或50%乙二醇。任何上述处理后应立即用10倍柱体积1×GST结合/漂洗缓冲液平衡。树脂可以在4℃，20%乙醇/80%水中长时间存放。
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