【Merck】c-Myc标签融合蛋白的亲和纯化

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Merck IP0020 A7470 E6654 A7470 P2714 P8465 P8340 P8215 P9599 P1860

c-Myc 是一个11 个氨基酸的小肽，源于人c-Myc 蛋白表位，分子量1.4kDa；用于重组蛋白的亲和纯化、免疫沉淀、Western Blot 和流式细胞检测等。

抗c-Myc琼脂糖是将兔生产经亲和纯化的抗c-Myc抗体结合到溴化氰活化琼脂糖上制得的。经纯化的抗体以1-1.5mg/mL固定到琼脂糖。抗c-Myc由兔生产，抗原是人c-Myc 408-425氨基酸序列。抗c-Myc识别重组蛋白上Myc标签。该抗体与N-和C-端c-Myc标签融合蛋白反应，可用于免疫沉淀和免疫亲和纯化。

下面介绍用抗c-Myc琼脂糖亲和纯化c-Myc标签融合蛋白的操作方法：

需要的试剂及设备

• 抗c-Myc琼脂糖（货号A7470）

• 含表达c-Myc标签融合蛋白的细胞样品

• PBS缓冲液，氢氧化铵，乙酸

• 蛋白酶抑制剂混合物（通用于细菌、哺乳动物、真菌及酵母、植物以及组织培养物）（货号P2714, P8465, P8340, P8215, P9599和P1860)

• 色谱柱

• 分光光度计

操作指南

优化选做：

• 对于包含染色DNA或RNA很粘稠的样品可以进行超声或核酸酶处理以降低粘度。

•在柱上纯化之前，样品需经过离心或过滤去除影响操作的细胞碎片和颗粒物。

以下步骤均在室温下进行。

A. 组装柱子

1. 将空柱子固定好。

2.用PBS（货号D8537）浸洗柱子。

3. 使缓冲液流出柱子，留少量PBS有助于装载c-Myc琼脂糖。

B. 填料装柱

1. 充分重悬c-Myc琼脂糖珠以获得均匀的树脂悬液。

2.立即取需要的量转到柱子，使琼脂糖沉降形成柱床。

▲tips：柱子在glycine-HCl中不能超过20min。

C. 洗柱

用5ml 0.1M pH11-12氢氧化铵连续3次洗柱，紧接着用5ml PBS连续3次洗柱。加入液体时注意避免扰动琼脂糖柱床。

D. 将c-Myc标签融合蛋白结合到柱子上

1. 在重力流下将裂解物上样到柱子上。

▲tips：不同的融合蛋白和流速，有些蛋白不会结合。可多次反复上样，或上样后关闭柱子下端，摇晃孵育约 1hr，以改善结合效率。

2. 收集“流穿”的未结合蛋白。

3.用PBS洗柱至OD280 = 0.01。

E. 洗脱c-Myc标签融合蛋白

采用10x1ml 0.1M氢氧化铵pH11-12从柱子上洗脱结合的c-Myc标签融合蛋白，每份洗脱下的样品在含30-50μl 1N乙酸中中和。

▲tips：在低pH环境下暴露较长时间柱子可能失活。

默克生命科学c-Myc相关纯化/免疫沉淀产品

类型	产品描述	特点	包装	目录号
IP 试剂盒	Anti-c-Myc Immunoprecipitation Kit	采用CelLytic M高效裂解哺乳动物细胞，并用甩柱法高特异性地进行cMyc融合蛋白免疫沉淀，操作方便，数据稳定	50次	IP0020
树脂	Anti-c-Myc Agarose Affinity Gel antibody produced in rabbit	采用纯化的人源多抗单抗，推荐用于亲和纯化和免疫沉淀，结合载量2nmol/mL，洗脱采用1.5nmol/mL	1mL	A7470
红色树脂	EZview™ Red Anti-c-Myc Affinity Gel	鲜艳的红色凝胶推荐用于免疫沉淀，操作更方便，样本损失小，数据更稳定；载量50μg/mL	1mL, 5×1mL	E6654