【Merck】包涵体蛋白提取

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Merck C5236 B3553 B3678 B6916 D5545 U6504 CELLYTPN1 539790 NXTRACT 71183 71772 CE0050 PROTTWO LYSISO1 MITOISO1 MITOISO2 QIA88 MITOISO3 ER0100 GL0010 PEROX1 17-10195 17-10210 CPISO

重组蛋白质在大肠杆菌中的高水平表达往往导致蛋白质聚集形成不溶性的包涵体。无活性的包涵体蛋白质需要经过复性使其折叠成为具有天然构象和生物活性的蛋白质。

下面介绍包涵体溶解和复性的方法。

需要的耗材及设备

需要的耗材及设备

• CeLytic IB包涵体溶解试剂（货号C5236）

• 离心机和合适的离心管

• 振荡器，摇板/混匀器

操作指南

一、纯化和溶解

1. 参照CelLytic B (货号B3553)或CelLytic B-II (货号B3678)或其他细胞裂解纯化产品操作说明得到经纯化的包涵体。

2. 估算包涵体的量，可以通过含有包涵体沉淀试管的总重减去空试管重量获得。

3. 湿重每g包涵体沉淀加入8ml CelLytic IB试剂。

4. 涡旋重悬1min。

5. 室温下摇晃30min。

6. 室温下16,000xg离心15min以去除细胞碎片。

7. 离心后小心去除含可溶蛋白的上清。

8. 可以采用Bradford试剂(货号B6916)对可溶蛋白进行定量分析。如果进行SDS-PAGE分析，需要先用透析或TCA沉淀处理去除变性剂。

二、重折叠

要经过重折叠才能获得有活性的蛋白。成功的重折叠高度依赖于从变性的蛋白去除变性剂而不发生聚集的复性操作。常用的变性蛋白重折叠有几种方法，包括稀释，透析，渗滤和凝胶过滤色谱等。不同蛋白的折叠特性不同，每个蛋白的重折叠也是个性化的，需要进行个别摸索来确定。以下的透析法可以作为参考。如果采用其它重折叠方法请查看相关文献。

三、透析法重折叠

1. 根据前述操作纯化和溶解包涵体。

2. 在溶解步骤加入5mM DTT(货号D5545)以减少二硫键的形成。

3. 在一个3L的烧杯中配制1L 6M尿素（货号U6504)溶液。

4. 将蛋白溶液移入合适截留分子量的透析管中。

5. 4°C下蛋白溶液在6M尿素溶液中透析6h，持续搅拌。

6. 配制2L 25mM Tris-HCl, pH 7.5。

7. 将500ml 25mM Tris-HCl, pH 7.5加入3L 6M尿素溶液中。4°C下蛋白溶液透析12h，持续搅拌。

8. 将250ml 25mM Tris-HCl, pH 7.5加入以上溶液。4°C下蛋白溶液透析6h，持续搅拌。

9. 重复步骤7和8直至透析液体积达到3L。

10.用2L 25mM Tris-HCl, pH 7.5和150mM NaCl替代上述透析液。4°C下蛋白溶液透析6h，持续搅拌。

11.从透析管中取出蛋白溶液。如果透析过程中出现沉淀，通过离心或0.45μM孔径PES滤器过滤。现在蛋白溶液可以进行SDS-PAGE或活性分析了。

四、默克生命科学提供齐全的细胞组分蛋白/细胞器富集产品

蛋白样品的精制可以通过特定亚细胞组分富集来完成，而针对特定细胞器进行富集也是使蛋白质组学得以简化和精确的有效手段。

有效分离的蛋白样品结合蛋白质代谢功能信息能够帮助我们深入了解关于健康细胞功能和细胞功能干扰导致的疾病。默克生命科学富有创造性的试剂盒支持研究者能够富集功能性溶酶体、线粒体、内质网等，同时配套的试剂盒和抗体能帮助检验细胞器完整性。

从不同生物中分离细胞器 -起始材料包括哺乳动物组织和培养细胞，植物叶片和酵母细胞产生功能性完整的细胞器抽提效果监控 - 采用配套的试剂盒能轻松确认细胞器结构完整性。

从不同生物中分离细胞器-起始材料包括哺乳动物组织和培养细胞，植物叶片和酵母细胞

产生功能性完整的细胞器- 适合功能性研究，代谢物分析和蛋白质谱分析

抽提效果监控 - 采用配套的试剂盒能轻松确认细胞器结构完整性

样本	分离/富集组分	产品描述	包装规格	目录号
植物叶片	细胞核，功能性核蛋白	CelLytic™ PN Isolation/Extraction Kit	30次	CELLYTPN1
哺乳动物组织、细胞	亚细胞蛋白质组四个组分：细胞质、细胞核、细胞膜、细胞骨架蛋白	ProteoExtract® Subcellular Proteome Extraction Kit	20次	539790
哺乳动物新鲜 / 冰冻组织、细胞	细胞核，功能性核蛋白	CelLytic™ NuCLEAR™ Extraction Kit	100次	NXTRACT
哺乳动物细胞	核蛋白	NucBuster™ Protein Extraction Kit	100次	71183
哺乳动物组织、细胞	膜蛋白，多次跨膜蛋白	ProteoExtract® Transmembrane Protein Extraction Kit	20次	71772
哺乳动物细胞	膜蛋白	CelLytic™ MEM Protein Extraction Kit	80次	CE0050
哺乳动物细胞	膜蛋白，胞质蛋白	ProteoPrep® Universal Extraction Kit	10次	PROTTWO
哺乳动物组织、细胞	溶酶体	Lysosome Isolation Kit	20mL细胞或25g组织	LYSISO1
哺乳动物软/硬组织	线粒体	Mitochondria Isolation Kit	10-20g组织，5 0 次JC-1分析	MITOISO1
哺乳动物软/硬组织	线粒体	Mitochondria Isolation Kit	10-20g组织，5 0 次JC-1分析	MITOISO2
哺乳动物细胞	线粒体，胞浆蛋白	ProteoExtract®Cytosol/Mitochondria Fractionation Kit	100次	QIA88
酵母	线粒体	Yeast Mitochondria Isolation Kit	40次	MITOISO3
哺乳动物软组织、细胞	内质网	Endoplasmic Reticulum Isolation Kit	50g组织	ER0100
哺乳动物软组织、细胞	高尔基体	Golgi Isolation Kit	50g组织	GL0010
哺乳动物组织、细胞	过氧化物酶体	Peroxisome Isolation Kit	20mL细胞或50g组织	PEROX1
贴壁培养细胞	细胞骨架蛋白	ProteoExtract® Cytoskeleton Enrichment and Isolation Kit	15次	17-10195
贴壁培养细胞、切片	细胞骨架蛋白	ProteoExtract® Native Cytoskeleton Enrichment	32次	17-10210
植物叶片	叶绿体	Chloroplast Isolation Kit	18次	CPISO