【Merck】FLAG标签融合蛋白的亲和纯化：琼脂法

FLAG标签（即DYKDDDDK）是一种经精心设计的、仅有8个氨基酸的人工序列，用于蛋白纯化和检测。已广泛用于各种细胞类型。这个小肽分子量仅为1.01kDa，却有着别的标签不具备的显著优势：

• 对目的蛋白没有干扰-不会占据表位与结合域，避免导致融合蛋白的功能、分泌性以及转运发生改变

• 纯度高-M2抗体特异性极佳，通常FLAG纯化得到的蛋白纯度足够高而不需要进一步纯化

• 亲水性好-定位在融合蛋白表面，非变性亲和层析获得有活性的高纯度蛋白

• 灵敏度高-不论标签N-/C-端或内部，均可被抗FLAG的抗体识别，灵敏度是其它标签的20–200倍，达到<10fmol

• 去除方便-融合在N端 的FLAG，其 可 以 被 肠 激 酶 切 除（DDDK）而 得 到 天 然 目 的 蛋 白

• 应用广泛-用于细菌、酵母和哺乳细胞系统，可以用IP-coIP/IHC/ICC/IF/WB/ELISA/流式细胞等检测、鉴定

根据与FLAG抗体偶联的树脂材质的不同，可以分为琼脂糖法和磁珠法，下面介绍琼脂糖法的操作方法。

• ANTI-FLAG^® M2亲和琼脂糖胶(货号A2220)

• 表达FLAG融合蛋白的细胞样品

• 裂解液：哺乳动物细胞裂解液CelLytic M（货号C2978）或大肠杆菌裂解液CelLytic B（货号B7435 / B7310 /C8740），或自行配制裂解液（50mM Tris HCl，pH 7.4，150mM NaCl，1mM EDTA，1% TRITON X-100）

• 离心机

• 柱子，离心管

• NaCl（货号S3014）

• Trizma® base（货号T6066）

• 蛋白酶抑制剂混合物（货号P8340）用于哺乳动物细胞和组织样品

第一部分：裂解细胞

（一）大肠杆菌

1. 在诱导FLAG融合蛋白表达条件下培养（～1L）细胞。

2. 2-8°C 5,000g离心30min收集细胞。

3. 倾去培养基，保留细胞沉淀。

4. 用干冰-乙醇冰浴或在–20°C冰箱将细胞沉淀冻起来一般为液氮速冻可增加细胞破裂。

5. 每g冷冻细胞糊用10ml CelLytic B（货号B7435）或5ml 2×浓缩的CelLytic B（货号B7310）裂解。

6. 用移液枪将细胞在CelLytic B中重悬。在搅拌器上混匀15min以充分抽提蛋白。

7. 21,000g离心15min去除细胞碎片。

8. 离心后将上清移入一个新试管，弃去细胞沉淀。此时样品溶液应该是澄清无不溶颗粒的。

（二）哺乳动物细胞样品

每个融合度为70–90%的100mm培养皿（约10⁶–10⁷个细胞），需要1ml裂解缓冲液（50mM Tris HCl, pH 7.4, 150mM NaCl, 1mM EDTA, 1% TRITON X-100）。如果FLAG融合蛋白表达水平非常低，可适当减少裂解液的用量。强烈建议在裂解液中加入蛋白酶抑制剂混合物（货号P8340，10ml/ml裂解液），特别是裂解物要存放起来以备将来使用的情况。

1.清洗贴壁或悬浮细胞：

贴壁细胞–去除用于分析的细胞上的培养基。用PBS缓冲液（10mM磷酸盐，2.7mM KCl，137mM NaCl，pH7.4，25°C）浸洗2次。小心不要冲散细胞。弃去PBS。加入裂解缓冲液CelLytic M（货号C2978）1ml/10⁶–10⁷个细胞重悬。

悬浮细胞–将细胞样品放入锥底离心管。420g离心5min。弃去上清。用PBS重悬及420g离心5min漂洗细胞两次。弃去上清。用裂解缓冲液CelLytic M（货号C2978）1ml/10⁶–10⁷个细胞重悬。

2.在摇板上孵育细胞15–30min。

3.贴壁细胞需要刮下收集。悬浮细胞直接进行步骤4。

4.12,000g离心10min。

5.上清转入一个新的预冷试管。如果立刻使用就置于冰上。如果不马上使用则将上清存放于–70°C。

第二部分：树脂的准备

ANTI-FLAG M2亲和树脂产品是含50%甘油和缓冲液的悬浮液。只有在使用前才去掉甘油，并用缓冲液平衡树脂。平衡可以在常温或2–8°C下操作。每次只取用纯化操作需要用量的树脂。充分重悬树脂。树脂悬浮液即可倒入标准操作用到的干净的柱子。树脂在TBS缓冲液中放置不要超过24hr，除非其中加入抗菌剂（如0.02%叠氮化钠）。

1.固定好空柱。

2.用TBS (50mM Tris HCl，150mM NaCl，pH 7.4)或同等的缓冲液冲洗空柱子两次。让缓冲液从柱子流出，在柱子中留下一些TBS以助于ANTI-FLAG M2亲和胶的装柱。

3.温和颠倒将树脂充分混匀。确保瓶中的ANTI-FLAG M2亲和胶悬浊液非常均匀。取出纯化需要的用量。

4.立刻将悬浊液加到柱子里。

5.让树脂沉降，并用TBS冲洗用于取用树脂的枪头。50%甘油缓冲液流速很慢，随着平衡过程的进行流速会加快。

6.将树脂加入柱子沉降，随着缓冲液的流出树脂自然形成柱床，足够的缓冲液可以使柱床均匀。注意不要让柱床干掉。

7.连续用3倍柱体积的0.1M glycine HCl, pH 3.5洗胶。小心加入试剂注意不要冲坏柱床。每次加液前等待前次加入的液体流净。柱子在glycine HCl中不能超过20min。

8.用5倍柱体积的TBS淋洗树脂，平衡树脂备用。不要让柱床干掉，在柱子顶端保留少量缓冲液。

第三部分：亲和纯化

FLAG融合蛋白可采用柱式或批次纯化。柱纯化采用1–3ml树脂，对应100ml以内的细胞裂解物。更大体积的裂解物，推荐采用批次纯化方式，可以在大体积抽提物中快速结合目的蛋白。如果样品更少（如1–2ml细胞裂解物）则可以采取免疫沉淀方式进行纯化（此部分请参考第?页“FLAG标签融合蛋白的免疫沉淀”部分）

（一）柱层析

在室温下预平衡柱子，准备缓冲液并进行纯化。如果顾忌蛋白酶的影响，可以在2–8°C进行层析，或者在洗脱液中加入蛋白酶抑制剂混合物。细胞碎片和颗粒物会堵塞柱子，必须在纯化前去除。高度粘稠的含有染色质DNA或RNA的样品也容易堵柱，需要用Benzonase核酸酶（货号E1014）处理以降低粘性。FLAG-BAP阳性对照蛋白可以用来评估胶的性能。

A. FLAG融合蛋白结合到柱子上

1.FLAG融合蛋白与ANTI-FLAG M2亲和柱的有效结合需要0.15M NaCl和中性pH条件。

2.将样品加到柱子上进行重力流操作。依蛋白和流速不同，抗原不一定会被全部结合。多次过柱可以改善结合效果。

3.用10-20倍柱体积的TBS洗柱。这样可以去除M2不结合的杂蛋白。将柱子控干。

B. 选择两种方式之一进行洗脱

用酸性条件甘氨酸洗脱FLAG融合蛋白：用6×1ml 0.1M glycine HCl, pH3.5（含15–25µL 1M Tris, pH8.0）洗脱FLAG融合蛋白。不要将柱子留在glycine HCl中超过20min。洗脱后尽快再平衡至中性pH。

或者采用FLAG多肽竞争性洗脱FLAG融合蛋白：用5个1倍柱体积TBS缓冲的含100µg/ml FLAG多肽（货号F3290）竞争性洗脱FLAG融合蛋白。

C. 柱子再生

建议柱子在使用后立即再生。处理方式是用3倍柱体积的0.1M glycine HCl, pH3.5漂洗。其后柱子要立即用TBS再平衡，直到流出液为pH中性。

D. 柱子的保存

用10倍柱体积含50%甘油和0.02%叠氮化钠的TBS或PBS缓冲液洗柱，接着再加5ml含0.02%叠氮化钠的甘油缓冲液，存放于2–8°C或–20°C，注意不要漏液干掉。

E. coli 周质抽提物上柱，柱子可以重复使用20次而不损失结合载量。E. coli 粗制裂解物上柱，结合载量下降之前可以重复使用3次。重复使用次数受很多因素影响。

（二）批次纯化

本方法可以从较为稀释的溶液中快速有效地纯化FLAG融合蛋白。省去了费时的柱层析步骤而代之以用少量树脂进行大体积样品的纯化。

A. 将蛋白抽提物的pH调至pH7–8。加入至少0.15M的盐（如NaCl或KCl）有助于减少杂蛋白非特异性结合到树脂上。

B. FLAG融合蛋白抽提物预先要去除所有不溶物。多数不溶物可通过10,000–20,000g离心15min去除。蛋白抽提物经过0.45或0.22µm孔径过滤器过滤可进一步去除所有会堵塞柱子的细胞及颗粒。也可在步骤F收集树脂时进行过滤。

C. ANTI-FLAG M2亲和胶用前需平衡。请参考“树脂的准备”部分。

D. 用TBS重悬树脂并将其加到蛋白抽提物中。

E. 蛋白抽提物和ANTI-FLAG M2亲和胶孵育约1hr以捕获FLAG融合蛋白，其间采用搅拌装置或摇板温和混合。不要用磁力搅拌器以免破坏树脂珠。这个步骤可以在2–8°C或室温下进行。孵育时间短则30min，也可长达数小时。如果孵育超过3hr，要加入蛋白酶抑制剂和抗菌剂以防止微生物滋生和蛋白水解。

F. 一旦结合步骤完成，从容器中收集树脂。可以采用1,000g离心5min，或过滤收集到空柱子或布氏漏斗。

G. 用TBS漂洗树脂去除非特异性结合蛋白。这一步可以在色谱柱中进行，用缓冲液洗柱直至没有更多的蛋白流出。可在280nm读数以确定是否存在蛋白。持续洗柱直至洗出液与空白洗液的吸光值差异小于0.05。

H. FLAG蛋白可用低pH或FLAG多肽竞争从树脂上洗脱。具体洗脱步骤请参考柱层析的B部分。

I. 树脂可循环使用和储存，请参考柱层析的C和D部分。

表1：试剂兼容性列表

默克生命科学提供完备的FLAG系列产品：

• Sigma拥有FLAG^®和ANTI-FLAG^®注册商标，纯化树脂/磁珠/抗体的质量被业界高度推崇

• 产品线配套齐全，全方位满足FLAG相关表达、纯化、检测等需求

• FLAG M2抗体性能尤为优越，不依赖Ca²⁺离子，可以识别所有形式的FLAG序列，包括N端Met-FLAG，形成的纯化琼脂糖/磁珠和检测抗体成为行业标杆产品

• 高分引用文献众多