【Merck】细胞破碎方法及操作指南

为了提取细胞中的蛋白质，采用有效的方法进行细胞破碎和固液分离是必要的。这是蛋白提取的第一步，通常是将处于细胞不同位置的蛋白释放出来，溶入已知成分的溶液内。该步骤是目的蛋白初级分离纯化阶段的重要环节，直接影响蛋白的回收率及纯度。

下面总结了几种常见细胞破碎方法的原理和特点：

原理：酶解法是利用各种水解酶（如溶菌酶、纤维素酶）将细胞壁和细胞膜消化溶解，使细胞内含物释放出来的方法。

特点及应用：利用此方法处理细胞必须根据细胞的结构和化学组成选择适当的酶。细菌主要用溶菌酶处理，酵母需用几种酶进行复合处理。使用酶解法时需注意控制温度、pH、酶用量和时间等因素。

下面介绍利用商品化的酶混合物BugBuster进行细胞破碎及抽提蛋白质的操作：

一、需要的耗材及设备

• 细菌培养液（含重组表达蛋白）

• BugBuster Master Mix抽提试剂（货号71456）

• 蛋白酶抑制剂混合物（货号04693132001等）

•离心机及合适的离心管

二、操作指南

（一）可溶蛋白抽提

1.用经预先称重的离心管10,000g离心10min液体培养体系收集细胞。如果是小规模培养（如1.5ml或更少），可以用1.5ml离心管14,000–16,000g离心。尽量倾去液体，称量细胞沉淀湿重。

2. 室温下用吸打或温和涡旋使BugBuster Master Mix与细胞沉淀混匀，每g细胞糊需要5ml抽提试剂。这相当于50ml培养液采用2.5ml抽提试剂。如果是小规模培养，则采用约1/5培养体积的抽提试剂重悬沉淀（例如1.5ml培养液采用300μl抽提试剂）。如果抽提试剂过量也没有什么副作用。

tips：抽提蛋白时记的加蛋白酶抑制剂。BugBuster Master Mix与蛋白酶抑制剂兼容。如果目的蛋白后续要用凝血酶（货号69671），Xa因子（货号69036）或重组肠激酶（货号69066）处理，就应该避免使用丝氨酸蛋白酶抑制剂。

3. 室温下将重悬的细胞液在摇板或低速转动搅拌器上孵育10-20min。

4.4℃下16,000g离心20min去除不溶的细胞碎片。如果需要，沉淀可以留作“包涵体纯化”（见以下说明）的材料。

5.将上清转入另一个新试管。这样抽提得到的可溶蛋白溶液可以直接上样于纯化树脂。蛋白溶液在冰上可以短时存放（2-3h），也可在-20℃长时间存放直至下步分析。蛋白抽提液应该根据目的蛋白的活性要求的温度存放，有些蛋白经冻融会失活。

（二）包涵体纯化

1. 按上述可溶蛋白抽提步骤1-4进行操作。

2. 将步骤“4”所得到的沉淀重悬于BugBuster Master Mix（以下简称BMM），BMM的量与当初重悬细胞糊的体积相同。吸打并涡旋以获得均匀的悬浮液。充分重悬沉淀能够溶解，去除杂蛋白以获得高纯度的包涵体。

3. 加入6倍体积的经1:10去离子水稀释的BMM重悬，涡旋1min混匀。

4. 于4℃ 5,000g离心15min以吸管移去上清，收集包涵体。

5. 将包涵体重悬于相当于原培养体系体积一半的经1:10稀释的BMM中，涡旋混匀，按步骤4离心。此步骤重复两次。再次重悬，于4℃ 16,000g离心15min去除上清。

6. 重悬最终的沉淀（即纯化的包涵体）于选定的缓冲液，最好是能与后续纯化方法兼容的缓冲液。

原理：采用去垢剂（如SDS、去氧胆酸等）破坏细胞膜从而使细胞破碎。

特点及应用：表面活性剂处理的条件比较温和，提取的蛋白活性较高，实验室中常用于提取动物细胞中的蛋白。

下面介绍利用商品化的含有去垢剂的细胞裂解液进行细胞破碎及抽提蛋白质的操作：

一、需要的耗材及设备

• RIPA裂解液（货号R0278）

• 生理性洗涤液（如Dulbecco磷酸盐缓冲液 [DPBS]，货号D8662）

• 哺乳动物组织用蛋白酶抑制剂混合液（货号P8340）

• 磷酸化酶抑制剂混合液

 抑制丝氨酸/苏氨酸磷酸化酶以及碱性磷酸酶的L-同工酶（货号P2850）

 抑制酪氨酸蛋白磷酸化酶，酸性及碱性磷酸化酶（货号P5726）

• 贴壁细胞用细胞刮（货号C2802）

• 离心机及合适的离心管

二、操作指南

（一）贴壁细胞的裂解

1.通过倾倒或吸取去除细胞上的生长培养基。

2.洗涤细胞以去除残留的培养基。小心缓慢加入与原始培养基相同体积的生理性洗涤液，如DPBS，并避免将细胞冲走。轻轻混匀后将洗涤液去除。重复洗涤一次以去除所有微量污染物。还可进行更多次洗涤，但通常两次即足够

3.在将最终的洗涤液从细胞上去除后，加入适当体积的RIPA裂解液（1ml用于0.5～5x107细胞）。在冰上或置于冰箱（2–8°C）内孵育5min。

4.用细胞刮快速刮下和裂解残留的细胞。将细胞裂解物转移至置于冰上的试管中。该裂解物可立即使用（继续步骤5）或在液氮中进行速冻后储存于–70°C以备后用。最好在裂解物变澄清前进行冷冻，因为冻融可能会造成某些变性蛋白聚集。

5.在4°C通过8,000xg离心10min，使裂解物澄清并将细胞碎片沉淀。

tips：如果出现黏液样的变性核酸聚集物，在离心前可通过微量移液器小心将其去除（更好的处理是用Benzonse核酸酶消化以去除核酸的干扰）。

6.将含有可溶性蛋白的上清小心转移至置于冰上的管中以用于免疫沉淀或其它分析。

（二）悬浮培养细胞的裂解

1. 通过450xg离心5min收集细胞沉淀。

2. 通过倾倒或吸取去除细胞上的生长培养基

3. 洗涤细胞以去除残留的培养基。小心缓慢加入与原始培养基相同体积的生理性洗涤液，如DPBS。简短混匀或涡旋将细胞完全重悬。450xg离心5min以将细胞沉淀并小心去除洗涤液上清。重复洗涤一次以去除所以微量污染物。还可进行更多次洗涤，但通常两次即足够。

4. 在将最终的洗涤液从细胞上去除后，加入适当体积的RIPA缓冲液（1ml用于0.5～5x107细胞）至细胞沉淀，简短混匀或涡旋将细胞完全重悬。在冰上或置于冰箱（2–8°C）内孵育5min。简短涡旋以将残留细胞进行重悬和裂解。

5. 裂解物可立即使用（继续步骤6）或在液氮中进行速冻后储存于–70°C以备后用。

6. 将含有可溶性蛋白的上清小心转移至置于冰上的管中以用于免疫沉淀或其它分析。