【Merck】膜蛋白提取操作指南

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Merck

Merck 71772-3

膜蛋白占据了生物体基因组大约20-30%的成分，充当着细胞的看门人、调节器和感应器的角色。膜蛋白具有多样的细胞功能，包括将细胞与外部的毒素隔离开来，作为胞内信号级联的起始点，以及维持临界离子浓度等，是理论研究和药物开发的热点。

需要的耗材及设备

• ProteoExtract®跨膜蛋白抽提试剂盒（货号71772-3）

• 磷酸盐缓冲液（PBS，137mM NaCl，10mM Na₂HPO₄，2.7mM KCl，1.8mM KH₂PO₄，pH7.4）

• 水平混合仪或椭圆混合仪

• 匀浆器（如Dounce组织研磨仪或Potter-Elvehjem组织匀浆器）或杵和臼（用于组织样本）

• 带有可适配15ml及50ml管转子的低温离心机

• 带有可适配2ml管并产生16,000xg转子的低温离心机

操作指南

一、贴壁培养细胞的膜蛋白抽提

1.通过使用Extraction Buffer 2对TM-PEK Reagent进行适当的2×稀释，制备Extraction Buffer 2A或2B。如从1-5x10⁷个细胞中进行膜蛋白抽提，则需要0.2ml Extraction Buffer 2A或2B。

• 如需制备0.2ml Extraction Buffer 2A，则将0.1ml Extraction Buffer 2与0.1ml TM-PEK Reagent A进行混合。

• 如需制备0.2ml Extraction Buffer 2B，则将0.1ml Extraction Buffer 2与0.1ml TM-PEK Reagent B进行混合。

▲tips：推荐对Extraction Buffer 2A及Extraction Buffer 2B均进行测试，以确定哪种最适合于你的目标蛋白使用Extraction Buffer 2A而制备的样本根据下游的应用可能需要进行浓缩。高水平的Reagent B在SDS-PAGE中对蛋白的迁移可能会产生干扰。可能需要在样本缓冲液中进行缓冲液交换或稀释。

在Extraction Buffer 2中对TM-PEK Reagent A或B进行的2×稀释就可以实现对绝大多数蛋白有效的抽提，但也可能需要对试剂的稀释比例进行优化（从未稀释至10×稀释）。

2.去除培养瓶中的培养基。

3.用PBS在4°C将细胞洗涤2次。

4.加入3ml PBS至培养瓶中。使用细胞刮将细胞刮下，并转移至15ml锥形管中。

5.在4°C进行1000×g离心5min（或者通过在4°C进行500×g离心10min进行细胞收集）。

6.用1ml Extraction Buffer 1+5μl Protease Inhibitor Cocktail Set III进行细胞悬浮。

7.在4°C孵育10min，并伴随着轻轻的晃动以避免产生细胞块。

8.在4°C进行1000×g离心5min。

9.小心去除上清并放置冰上，这便是“胞质（可溶性）”蛋白组分。

10.用0.2ml Extraction Buffer 2A + 5μl Protease Inhibitor Cocktail Set III或0.2ml Extraction Buffer 2B+5μl Protease Inhibitor Cocktail Set III进行沉淀悬浮。

11.在室温孵育45min，并伴随轻轻的晃动。

▲tips：为了提升抽提的效率或保持靶标蛋白的活性，可以改变第11步的孵育时间和温度。延长孵育时间（最长达120min）可提高蛋白的回收，但会导致靶标蛋白活性的下降。相反，低温孵育（4°C）可更好地保持蛋白活性，但可能会降低抽提的效率。

12.在4°C进行16,000xg离心15min。

13.将富集了跨膜蛋白的上清转移至一支新管中。

▲tips：如果当天进行分析，则将胞质和膜蛋白组分置于冰上。如需长期储存，则分装后保存在–20°C。

14.通过BCA测定法对胞质和膜蛋白组分的蛋白浓度进行测定。

▲tips：对于某些细胞类型，膜蛋白组分的总蛋白浓度（上述第13步）将会>1.0mg/ml。可能需要利用无菌去离子水进行2至4倍的稀释，将这些样本的浓度降低至BCA标准曲线的线性范围内。

二、悬浮细胞或冷冻细胞沉淀的膜蛋白抽提

1.通过使用Extraction Buffer 2对TM-PEK Reagent进行适当的2×稀释，制备Extraction Buffer 2A或2B。如从1.0–5.0x10⁷个细胞中进行膜蛋白抽提，则需要0.2ml Extraction Buffer 2A或2B。

• 如需制备0.2ml Extraction Buffer 2A，则将0.1ml Extraction Buffer 2与0.1ml TM-PEK Reagent A进行混合。

• 如需制备0.2ml Extraction Buffer 2B，则将0.1ml Extraction Buffer 2与0.1ml TM-PEK Reagent B进行混合。

▲tips：推荐对Extraction Buffer 2A及Extraction Buffer 2B均进行测试，以确定哪种最适合于你的目标蛋白。

使用Extraction Buffer 2A而制备的样本根据下游的应用可能需要进行浓缩。高水平的Reagent B在SDS-PAGE中对蛋白的迁移可能会产生干扰。可能需要在样本缓冲液中进行缓冲液交换或稀释。

2.将1-5x10⁷个细胞转移至一支离心管中。

3.在4°C进行1000×g离心5min（或者通过在4°C进行500×g离心10min进行细胞收集）。

4.去除上清并用5ml PBS（4°C）轻轻进行细胞悬浮。

5.在4°C进行1000×g离心5min。

6.重复第4和第5步2次，即总共进行3次洗涤。

7.在4°C进行1000×g离心5min。

▲tips：在此时，细胞可通过液氮进行冷冻并储存在–70°C。

8.用1ml Extraction Buffer 1 + 5μl Protease Inhibitor Cocktail Set III进行细胞悬浮。

9.在4°C孵育10min，并伴随着轻轻的晃动以避免产生细胞块。

10.在4°C进行1000×g离心5min。

11.小心去除上清并放置冰上。这便是“胞质（可溶性）”蛋白组分。

12.用0.2ml Extraction Buffer 2A + 5μl Protease Inhibitor Cocktail Set III或0.2ml Extraction Buffer 2B + 5μl Protease Inhibitor Cocktail Set III进行沉淀悬浮。

13.在室温孵育45min，并伴随轻轻的晃动。

▲tips：为了提升抽提的效率或保持靶标蛋白的活性，可以改变第13步的孵育时间和温度。延长孵育时间（最长达120min）可提高蛋白的回收，但会导致靶标蛋白活性的下降。相反，低温孵育（4°C）可更好地保持蛋白活性，但可能会降低抽提的效率。

14.在 4°C进行16,000xg离心15min。

15.将富集了跨膜蛋白的上清转移至一支新管中。

▲tips：如果当天进行分析，则将胞质和膜蛋白组分置于冰上。如需长期储存，则分装后保存在–20°C。

16.通过BCA测定法对胞质和膜蛋白组分的蛋白浓度进行测定。

▲tips：对于某些细胞类型，膜蛋白组分的总蛋白浓度（上述第13步）将会>1.0mg/ml。可能需要利用无菌去离子水进行2至4倍的稀释，将这些样本的浓度降低至BCA标准曲线的线性范围内。

三、组织膜蛋白的抽提

1.通过使用Extraction Buffer 2对TM-PEK Reagent进行适当的2×稀释，制备Extraction Buffer 2A或2B。如从25-50mg细胞中进行膜蛋白抽提，则需要0.2ml Extraction Buffer 2A或2B。

如需制备0.2ml Extraction Buffer 2A，则将0.1ml Extraction Buffer 2与0.1ml TM-PEK Reagent A进行混合。

如需制备0.2ml Extraction Buffer 2B，则将0.1ml Extraction Buffer 2与0.1ml TM-PEK Reagent B进行混合。

▲tips：推荐对Extraction Buffer 2A及Extraction Buffer 2B均进行测试，以确定哪种最适合于你的目标蛋白。使用Extraction Buffer 2A而制备的样本根据下游的应用可能需要进行浓缩。高水平的Reagent B在SDS-PAGE中对蛋白的迁移可能会产生干扰。可能需要在样本缓冲液中进行缓冲液交换或稀释。

2.确保所有的缓冲液都完全解冻并充分混匀。抽提过程中需要将Extraction Buffer 1、2A以及2B都放置于冰上

▲tips：Protease Inhibitor Cocktail Set III在抽提过程中必须放置在常温条件下以防止DMSO被冻住。

3.在完成目标组织的切割后，快速将不需要的部分（如结缔组织、脂肪、血管等）进行去除。如需减缓蛋白裂解，可在切割过程中将组织置于4°C。

4.快速将组织切割成~2mm3的小块。将组织切片加入含有2ml冰冷PBS的管中。

5.通过轻弹管壁将血细胞和其他松散贴附的物质进行移除。

6.通过在4°C进行100xg离心2min而收集组织块。弃上清。

7.重复第5和第6步而达到总共2次洗涤。在第二遍洗涤后，确保所有的PBS都被完全去除。

▲tips：在此时，组织可通过液氮进行冷冻并储存在–70°C。在组织抽提的过程中，动作小心快速很重要。在这个抽提过程中需保持样本低温（<4°C）并将缓冲液置于冰上。

8.将组织（新鲜或冷冻）转移至一支预冷的匀浆仪中。理想情况下，推荐使用玻璃的Potter-Elvehjem或Dounce匀浆仪。

9.加入5μl Protease Inhibitor Cocktail Set III至匀浆仪壁上。

10.加入2ml预冷的Extraction Buffer 1至匀浆仪中。

11.小心进行匀浆直至组织被完全均质化并看不到完整的组织块。尽可能使用少的匀浆次数（如50mg小鼠肝脏~20次）。匀浆的次数将取决于所用组织的类型。如果需要的话，可通过相差显微镜监测匀浆的效率。有效的匀浆应当可产生小的细胞团而不是将单个独立的细胞进行碎片化。

▲tips：某些组织（如心脏、肌肉、电脑）可能难以通过机械匀浆而进行完全的解离。可采用含有胶原酶的ProteoExtract Tissue Dissociation Buffer Kit（货号539720）作为替代方案。其他组织特异性的操作方法也可能与TM-PEK试剂盒兼容。

12.在4°C孵育10min，并伴随着轻轻的晃动。

13.在4°C进行1000xg离心5min。

14.小心去除上清并放置冰上。这便是“胞质（可溶性）”蛋白组分“。

15.加入5ml冰冷PBS。小心将沉淀进行悬浮，在4°C进行1000xg离心5min以对膜蛋白进行收集。小心去除上清。

▲tips：当使用>200mg组织时，可在此时进行额外一步的洗涤以去除多余的胞质蛋白。重复第15步以达到总共2次的洗涤。

16.用0.2ml Extraction Buffer 2A + 5μl Protease Inhibitor Cocktail Set III或0.2ml Extraction Buffer 2B + 5μl Protease Inhibitor Cocktail Set III对沉淀进行完全且小心的重悬。

17.在4°C孵育15min，并伴随着轻轻的晃动以避免产生细胞团。

18.在4°C进行16,000xg离心15min。

19.将富集了跨膜蛋白的上清转移至一支新管中。

▲tips：如果当天进行分析，则将胞质和膜蛋白组分置于冰上。如需长期储存，则分装后保存在–20°C。

20.通过BCA测定法对胞质和膜蛋白组分的蛋白浓度进行测定。

▲tips：对于某些组织类型，膜蛋白组分的总蛋白浓度（上述第19步）将会>1.0mg/ml。可能需要利用无菌去离子水进行2至10倍的稀释将这些样本的浓度降低至BCA标准曲线的线性范围内。

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