【Merck】类器官冻存方案
原理简介
类器官可以使用标准细胞冷冻技术进行冷冻保存，但冷冻/解冻后的细胞活力仍然是一个挑战。
3dGRO™ 类器官冷冻培养基是一种针对多种类器官细胞类型的专有优化冷冻保存培养基。与其他商业或自制类器官冷冻培养基配方相比，该培养基支持更高的冷冻/解冻后细胞活力。
操作指南
类器官冷冻保存方案
当类器官成熟并可传代时，在每个冷冻管中冷冻≥200个类器官。以下实验方案用于冷冻单一冷冻管。
1. 在实验前准备好所有需要的培养基和试剂。在冰上解冻3dGRO™ 类器官冷冻培养基。
2. 计算圆滴中存在的类器官的数量。如果一个圆滴包含少于200个类器官，则合并多个孔。
3. 吸出培养基。在每个孔中加入1 mL PBS。使用p1000移液器，上下吹打10次，将类器官圆滴分离成更小的碎片。将分离的类器官混合物（必要时混合多个圆滴）转移至50 mL锥形管中。
4. 用0.5 mL PBS冲洗孔并将上清液混合至锥形管中。在 4°C下500-650xg离心5分钟，
5. 小心吸出上清液，留下约100 μL培养基。
注意：不要触碰吸入底部沉淀，否则可能会无意中吸入较小的类器官。
6. 加入10 mL DMEM/F-12或DMEM培养基洗涤沉淀。轻轻地上下吹打一次。在4°C下650-700xg离心悬浮液5 分钟。
7. 小心吸出上清液，留下大约50-100 μL培养基。使用 20 μL移液管吸头，小心取出剩余的培养基。
8. 将类器官沉淀重悬于适量冰冷 (2-8°C) 的3dGRO™ 类器官冷冻培养基中。避免过度吹打。不要将沉淀解离为单个细胞。
9. 向每个标记的冷冻管中分装1 mL。将冷冻管放入装有异丙醇的 Mr. Frosty容器中。
10.将冷冻容器转移至-80°C冰箱中；24小时后，将冷冻管转移至液氮(-135°C)中进行长期储存。不建议在 -80°C下长期储存。
图1. 3dGRO™ 类器官冷冻培养基支持多种细胞类型的高冷冻/解冻细胞活力，包括小鼠肠道类器官(A)和人 iPSC衍生的结肠类器官 (B)。图像代表优化的类器官扩增培养基中冷冻/解冻后的第10天的类器官形态。
图2. 与CryoStor CS10相比，在3dGRO™ 类器官冷冻培养基中冷冻保存的小鼠肠道类器官在冷冻/解冻后产生更多的存活类器官。
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